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导读
由于饲养管理水平差等问题，降低了猪体的抵抗力，间接导致了很多疾病的发生，比如脑炎。脑炎一旦发生，会严重危害猪只健康，而且对生产效益打击非常大。引起脑炎的病原体有很多，比如链球菌、伪狂犬、副猪嗜杆菌等疾病。但令人意想不到的是，支原体家族中的猪鼻支原体也与脑炎有关。本文的作者在奥地利四个不同仔猪生产场的仔猪的脑脊液或脑膜拭子中分离出猪鼻支原体，这些发病仔猪除了表现常见的关节炎、咳嗽症状外，还出现了明显的神经症状。相信你读了这篇文章后，会对猪鼻支原体有新的认识。
该翻译译文发现：
1、临床表现神经症状的，未必是链球菌和副猪嗜血杆菌引起的。
2、通过质谱仪器设备在神经症状的仔猪脑部检测到了唯一的猪鼻支原体，说明猪鼻支原体可能是引起猪脑膜炎的潜在病原体。
3、突然无症状死亡的仔猪的脑部也检测到了猪鼻支原体。
4、检测到猪鼻支原体的仔猪体内，具有纤维性化脓性胸膜炎、纤维性化脓性心包炎、纤维性化脓性腹膜炎、关节炎、纤维性化脓性脑膜炎、间质性肺炎。
背景
猪鼻支原体是猪上呼吸道的入侵者，被认为具有无处不在的分布。它主要以在断奶仔猪中引起多发性浆膜炎和多关节炎而闻名，尽管全身性扩散的机制尚不完全清楚。猪鼻支原体也与猪的其它疾病有关，如肺炎或中耳炎。但迄今为止，尚未发现它会引起中枢神经系统紊乱。本病例报告来自奥地利四个不同仔猪生产场的仔猪的脑脊液或脑膜拭子中分离出猪鼻支原体。
案例介绍
在农场1，保育仔猪出现咳嗽、僵硬运动和中枢神经体征。从两头表现中枢神经症状的仔猪的脑膜拭子中分离出来的唯一病原体是猪鼻支原体。仅在一头仔猪中观察到纤维性化脓性软脑膜炎。来自2号农场的两头保育仔猪中只有一头表现出轻度中枢神经体征，而且没有组织学病变，但从具有神经系统症状的仔猪脑脊液中分离出猪鼻支原体。从3号农场所发现的三头仔猪的脑脊液中均分离出猪鼻支原体，而且临床表现为中枢神经症状和化脓性软脑膜炎。此外，还从三头仔猪中的一头仔猪的脑脊液中分离出猪链球菌。在来自4号农场的两头仔猪中检测到纤维性化脓性软脑膜炎，这些仔猪在一夜之间死亡而没有显示任何临床症状，并且从两头仔猪的脑膜拭子中分离出猪鼻支原体。
结论
虽然因果关系尚未通过试验性感染和组织切片中病原体的原位检测得到证实，但在这四个案例中都分离到了鼻支原体，而没有发现其它病原体，这些结果提示猪鼻支原体可能是猪脑膜炎的致病病原。
前言
多年来，猪鼻支原体被认为是上呼吸道的共生病原。它分布广泛，主要作为次要入侵者。猪鼻支原体定植于呼吸道上皮，可损伤纤毛，减少上皮厚度。然而，它也可以在全身扩散后侵入关节和浆膜组织，这主要起源于定植的黏膜区域。然而，导致全身性扩散的确切机制知之甚少。3-10周龄猪的关节炎和多发性浆膜炎是全身感染的典型临床症状；日龄较大仔猪通常会发展为轻度关节炎。猪鼻支原体猪鼻支原体还与引起结膜炎、中耳炎、咽鼓炎、流产及肺部病变有关。在实验条件下，猪鼻支原体已被证明可诱发肺炎，伴有典型的支原体相关病变，如间质性肺炎、血管周围及支气管周围淋巴样细胞浸润。然而，在田间条件下，猪鼻支原体单独存在并不被认为会引起严重的肺部病变或呼吸系统综合征，但可能会通过加重由其它主要病原体（如猪繁殖和呼吸综合征病毒）引起的肺病病变而导致猪呼吸系统综合征。
在本病例系列中，我们报告了来自奥地利四个不同农场的具有中枢神经体征的仔猪的脑膜拭子或脑脊液中分离出猪鼻支原体。本病例的结果表明，猪鼻支原体是猪中枢神经系统的潜在病原体。到目前为止，仅有一份关于从实验感染仔猪的中枢神经系统中分离出的猪鼻支原体的报告，该仔猪具有严重关节炎，但没有中枢神经体征。然而，我们的研究结果表明， 猪鼻支原体可能导致猪神经系统疾病，跟在其它动物和人类中观察到的一些能入侵脑，导致中枢神经系统疾病的支原体属于一个群体。
案例介绍
所有病例的仔猪均由负责的兽医师转送到维也纳大学猪诊所。为此，负责的兽医将1至3号农场的急性病仔猪送去尸检和进一步的诊断性调查。两头在4号农场过夜死亡的仔猪被运送到维也纳大学猪诊所，并在当天尸检。在安乐死之前，大学猪诊所的兽医进行了临床检查。尸检、病理形态学、病理组织学检查由维也纳病理学研究所进行。对于细菌学和病毒学检查，样本分别提交给维也纳微生物研究所和病毒学研究所。参考既往的方法，圆环病毒2型和蓝耳病的聚合酶链式反应技术诊断，由维也纳病毒学研究所常规诊断方案进行。猪鼻支原体的诊断方法是使用弗里斯培养基和改良的SP4培养基从脑膜拭子（在Amies培养基中转运）或者脑脊液中分离出猪鼻支原体。简而言之，将脑膜拭子或100μl脑脊液放入900μl2SP样品制备缓冲液中，瞬时离心，100μl悬浮液转移到弗里斯培养基和改良SP4琼脂上，在37°C下5% CO2环境下孵育长达10天。每天使用体视显微镜检查培养板的支原体生长。为了确定分离的支原体的种属，采集单个菌落，在相应的肉汤培养基中富集培养，用质谱仪器的质谱分析法进行鉴定，如前面描述。为此，我们将商用布鲁克分类数据库与一个大型的内部文库结合使用，该文库目前包含810个柔膜细菌参考谱，包括所有支原体种标准菌株和来自所有可培养的临床分离株经过鉴定的菌株。利用质谱仪器的质谱分析法进行鉴定，所有猪鼻支原体参考谱对数分值在2.00以上的支原体分离株，明确地鉴定为猪鼻支原体，而其它柔膜细菌种（包括布鲁克分类数据库中的物种）的对数分值相当低，从未超过1.70。此外，使用常规细菌学检查的标准方案检查细菌样品中的其他微生物，包括用含有5%羊血的哥伦比亚琼脂和巧克力II琼脂在37℃、5% CO2的环境中培养72小时，或用一个哥伦比亚琼脂平板厌氧培养72小时。分离的菌落用质谱仪质谱分析法鉴定，如之前描述的。细菌和支原体的生长被半定量分级为少、轻、中、重。如前所述，通过聚合酶链式反应技术对副猪嗜血杆菌病进行检测。
分析
农场1
在一个有80头母猪和350头育肥猪的农场里，保育舍中20-30%的仔猪表现咳嗽、消瘦、运动僵硬，大约1%表现出中枢神经症状，如头部倾斜和运动障碍。保育猪的死亡率为5%。在维也纳的猪大学诊所，出现神经症状的两头8周大的小猪被安乐死和尸检。小猪A躺至侧卧位，无法移动，关节肿胀，咳嗽。仔猪B在移动时肢体僵硬，跗关节肿胀，头部倾斜。在尸检期间，腹部可见淡黄色腹水液（仔猪B），以及纤维蛋白索（两只仔猪）。A仔猪跗关节肿胀，滑膜含纤维液增多，软骨表面无明显异常，滑膜无明显炎症。此外，仔猪B的脑膜浑浊。两头仔猪的组织病理学病变包括纤维性化脓性胸膜炎、重度纤维性化脓性上心包炎和中度至重度纤维性化脓性腹膜炎。在两头仔猪中，观察到间质性、小叶内和支气管周围肺炎，而II型肺泡壁细胞增殖。在仔猪B脑膜的组织病理学检查中，检测到严重的软脑膜炎，主要是淋巴细胞性和部分纤维性化脓性。
对两头仔猪的肺组织、浆膜拭子、脑膜拭子和滑膜液进行细菌学检查。除了肺部的一些继发性入侵者（博氏杆菌（B.）、支气管败血症（仔猪B）、金黄色葡萄球菌（仔猪A））。猪鼻支原体是从包括脑膜拭子在内的样本中分离出的唯一病原体（中度至重度）。所有样本也通过聚合酶链式反应技术对副猪嗜血杆菌病进行了检测，结果均为阴性。由肺组织、气管支气管淋巴结和扁桃体组成的库，经开放阅读框7反转录聚合酶链式反应技术检测均为蓝耳病阳性，经开放阅读框5测序证实为蓝耳病亚型分离物。通过实时定量聚合酶链式反应技术调查猪圆环病毒2型的腹股沟淋巴结组织，得到了低于定量极限（
<1×104GE/毫克）的阳性结果。使用蓝耳弱毒疫苗和单剂量泰拉菌素在断奶时联合稳定蓝耳病，似乎可以成功地将损失降低到1%，并消除仔猪断奶后的中枢神经症状。
分析
农场2
在一个有50头母猪的产房和一个用稻草垫料的保育单元，没有全进/全出生产，仔猪从7到8周龄开始出现呼吸疾病症状。已知该农场为蓝耳病阳性，母猪每年使用蓝耳弱毒疫苗接种三次疫苗。在维也纳的大学猪诊所，两只幼猪被安乐死和尸检。在安乐死前的临床检查中，在仔猪A（7.50公斤）和仔猪B（15.00公斤）中均观察到呼吸疾病症状，而头部倾斜和消瘦迹象仅存在于仔猪A中。在尸检过程中，两只仔猪均出现重度粘连性心包炎和胸膜炎、中度至重度纤维性化脓性腹膜炎和重症肺炎。在两头仔猪的肺部，组织病理学上可识别中度至重度小叶内、间质性支气管肺炎，并伴有开始（仔猪B）或严重（仔猪A）纤维化。在仔猪A中，组织病理学检查还显示胃黏膜圆形细胞严重炎症浸润，以及右鼓室大疱的化脓性炎症，周围骨质开始溶解。
对两头仔猪的浆膜拭子和肺组织进行细菌学检查。脑脊液仅从仔猪A中取样，因为仔猪B没有显示任何中枢神经体征。通过聚合酶链式反应技术检测，两仔猪的浆膜拭子和仔猪A的脑脊液均为副猪嗜血杆菌病阴性。通过聚合酶链式反应在两只猪的肺组织中检测到猪肺炎支原体。猪鼻支原体是从两只仔猪浆膜拭子（重度）和仔猪A（重度）的脑脊液的成功培养出来的。从仔猪A的肺组织中培养出猪链球菌（S.）和支气管败血波氏杆菌（B. bronchiseptica）（轻级），浆膜拭子培养出猪链球菌（轻级）。在仔猪B中，仅在富集后才在肺组织和浆膜拭子中发现金黄色葡萄球菌（E.）和溶血性大肠杆菌（E.）。两组仔猪淋巴结组织的圆环病毒2型的实时定量聚合酶链式反应技术检测均为阴性，而由肺组织，气管支气管淋巴结和扁桃体组成的库在两头仔猪中均通过开放阅读框7反转录聚合酶链式反应技术检测蓝耳病为阳性。由于这些结果，蓝耳弱毒疫苗的使用已扩展到保育仔猪，以稳定该畜群中的蓝耳病。根据农场兽医的说法，农场的情况已经有所改善，但仍然不是最佳的，主要是由于管理问题。例如，由于经济原因，农民停止了断奶仔猪的蓝耳病疫苗接种。
分析
农场3
在奥地利的一个从分娩到育成的农场（320头母猪）中，观察到母猪发高烧和妊娠后期流产以及返情率增加。该农场以前是蓝耳阳性，但稳定，没有明显的临床症状，母猪流感检测也为阴性。在这次疫情爆发之后，断奶仔猪出现了严重问题，其特征是关节炎（占仔猪的4%），中枢神经体征（占仔猪的2%）和损失增加。仔猪从3-4周龄开始出现关节炎和咳嗽（高达50%的仔猪）。即使在治疗后，具有中枢神经体征的仔猪的死亡率也为100%。为了减少临床症状，使用蓝耳弱毒疫苗建立了母猪和后来仔猪的蓝耳病疫苗接种。
三头体重约9公斤的仔猪被送往维也纳的大学猪诊所进行安乐死和尸检。仔猪A和B以前曾接受过头孢喹肟治疗，并且所有猪在尸检前3周都接种了蓝耳病疫苗。三头仔猪都表现出中度（仔猪B和C）或严重（仔猪A）的一般行为下降，身体状况不佳和多关节炎的迹象，如跗关节和腕关节充血肿胀。仔猪C显示头部倾斜，运动不协调，呼吸声加重；仔猪B表现出严重的跛行，以及反应能力下降；仔猪A处于侧卧位，无法起立，并有耳尖坏死。在尸检期间，在所有仔猪中观察到轻度（仔猪B和C）或重度（仔猪A）纤维性腹膜炎。跗关节和腕关节滑膜内逐渐地充满浑浊的液体和纤维蛋白索。肺部表现肺炎的迹象，如肺不张，充血和肺气肿。从组织病理学上讲，在所有仔猪的肺部观察到支气管，细支气管和血管周围圆形细胞的浸润；在仔猪A和C的肺部，还观察到化脓性支气管肺炎。脑部组织病理学检查显示，所有仔猪的纤维性化脓性软脑膜炎（中度至重度级），同时伴有组织细胞数量增加，以及局部脑炎病变（图1）。此外，在仔猪A的脊髓中观察到中度化脓性脑膜炎，而在仔猪B和C的脊髓中只能检测到轻微的炎症迹象。通过实时定量聚合酶链式反应技术检测，三头仔猪的腹股沟淋巴结均为圆环病毒2型阴性。取样3头仔猪的腹膜拭子、脑脊液、滑膜液、肺组织和小肠进行细菌学检查。滑膜、脑脊液和腹膜拭子通过聚合酶链式反应技术检测副猪嗜血杆菌病阴性；在进行三头仔猪的脑脊液的猪鼻支原体培养过程中，其中仔猪A和仔猪B的猪鼻支原体生长成了单菌落，而仔猪C重度生长。虽然在仔猪B和C的样品中没有进一步发现值得注意的病原微生物，但从仔猪A的滑膜液、脑脊液和腹膜拭子培养出链球菌，以及来自肺组织中的支气管败血波氏杆菌和链球菌。对妊娠母猪接种猪链球菌和猪鼻支原体自体疫苗，刺激母源抗体的产生，成功地减少了断奶仔猪关节炎和中枢神经症状的发生。
图1 猪小脑组织学病变图
图1a + b脑的组织学病变。来自农场3的仔猪小脑的组织学切片，显示纤维性化脓性性脑膜炎，组织细胞数量增加；H&E染色；条长为100μma和50μmb。
分析
农场4
在奥地利一个有85头母猪（包含后备猪）的分娩场，乳猪偶尔会在没有任何临床症状的情况下发生死亡。由于之前也有过类似的急性死亡，所以猪场兽医决定对一头仔猪进行尸检；在这只仔猪中可见纤维蛋白索、轻度腹水，以及轻度心包积液。两只30日龄大，最近断奶的仔猪（均为5.20公斤）在几个小时内死亡，没有发病征兆，被转移到维也纳的大学猪诊所进行进一步调查。两头仔猪的身体状况都不太好，但从外部看不出疾病的迹象。在病理学检查期间，在两头仔猪中都观察到纤维性化脓性胸膜炎、腹膜炎和心包炎，以及肺充血和肺不张； 肺组织病理学检查显示，A仔猪局灶性化脓性支气管肺炎和B仔猪肺泡组织细胞增多症。在两头仔猪中，在大脑的组织病理学检查期间都观察到严重的纤维性化脓性脑膜炎；仅在仔猪A的一个腹股沟淋巴结中观察到化脓性和部分脓肿性淋巴结炎，通过实时定量聚合酶链式反应技术，两头仔猪的腹股沟淋巴结圆环病毒2型均为阴性。对于细菌检查，从仔猪中取样浆膜拭子、肺组织和脑膜拭子，并从仔猪A中额外取样心包拭子。在仔猪A中，在肺，心包和胸膜样本中发现溶血性曼氏体；分别在脓肿淋巴结和胸膜中发现金黄色葡萄球菌和莫拉菌，并从肺和脑膜拭子中培养出猪鼻支原体的单菌落。在仔猪B中，富集后的常规细菌检查为阴性，在肺（轻度）和脑膜拭子（中度）中仅发现猪鼻支原体。从那以后，在该农场没有进一步发生急性死亡或其他莫名其妙的临床症状。
所述病例发生在2016年（农场1），2017年（农场2）和2019年（农场3和4）。4 号养猪场与 13 号养殖场相距甚远，位于养猪场密度较低的地区。农场1，2和3是位于同一地区的仔猪生产场，具有高猪密度，理论上这可能表明这些农场之间存在流行病学联系。然而，来自这三个农场的猪鼻支原体分离株的全基因组测序和核心基因组多位点序列分型显示，分离株仅具有远亲相关，不包括我们研究中提出的病例之间的流行病学关系（未发表的数据）。
讨论
此前，只有一份关于猪鼻支原体定植于中神经系统的报告，目前尚不清楚猪鼻支原体会引起猪的中枢神经紊乱。由于这是第二份有关于中枢神经系统培养猪鼻支原体的报告，因此猪鼻支原体侵入中枢神经系统的机制是完全未知的，但可能与全身扩散到浆膜和滑膜组织的机制相似，这些机制也知之甚少。然而，不能排除猪鼻支原体从鼻咽粘膜直接进入大脑，例如通过听觉通路。
该研究没有确定猪鼻支原体是否仅在中枢神经系统定植还是也作为致病因子。然而，猪鼻支原体从8头仔猪的脑脊液或脑膜拭子中成功分离猪鼻支原体并在某种程度上能够大量培养而且这些仔猪都表现出中枢神经体征或组织病理学病变，或者两者兼而有之（表1）。只有来自2号养殖场的仔猪B没有出现任何中枢神经体征或组织病理学病变，也没有检查脑脊液或脑膜拭子。在六头仔猪中，纤维性化脓性或化脓性软脑膜炎提示与细菌性病原体有关。从五头小猪的中枢神经系统样本中未分离到细菌病原体，而猪链球菌是一种众所周知的猪脑膜炎常见病因，在一头小猪（3号农场，a号小猪）中发现，尽管它已经用头孢喹肟治疗过，同一农场的第二头小猪（3号农场，B号小猪）也发现了猪链球菌。这使得猪鼻支原体成为六头大脑中组织病理学损伤的仔猪中5头唯一可检测到的病原体，其中包括四头未接受抗生素治疗的仔猪，可能恰恰诱发这些病变的原因。然而，需要使用染色方法（例如原位杂交）来检测和定位猪鼻支原体，以证明猪鼻支原体与组织病理学病变的联系，但尚未在我们手中建立和验证。最后，通过实验性感染来复制出临床症状和或组织学病变，对于证明猪鼻支原体是猪脑膜炎的致病因子至关重要。
简称：猪鼻支原体（猪鼻支原体）、PRRSV （繁殖与呼吸障碍综合征病毒）、PCV2 （猪圆环病毒2型）、蓝耳弱毒（蓝耳弱毒疫苗）， （− ）阴性，（+） 生长少，（ + ）—轻度生长，（ ++ ）适度生长，（ +++） 重度生长。
链球菌和副猪嗜血杆菌病是最常见的中枢神经系统入侵者，以及可引起猪脑膜炎，这与我们的病例中发现的症状相似。两种病原体都通过侵入猪脑微血管内皮细胞（PBMECs）来穿过血—脑脊液屏障（B-CSFB）或血脑屏障（BBB），猪脑微血管内皮细胞（PBMECs）是血脑屏障（BBB）的一部分。它们还通过诱导白细胞介素-8的释放来增加血脑屏障的通透性，猪鼻支原体也具备这一特征，因为当猪骨髓来源的树突状细胞受到不同猪鼻支原体菌株的刺激时，导致不同水平的白细胞介素-8释放被证实。这可能表明，猪鼻支原体菌株之间侵入中枢神经系统的能力可能不同，这取决于它们通过目前未知的毒力因子诱导白细胞介素-8释放的能力。对于链球菌和副猪嗜血杆菌病，入侵取决于特定毒力因子的活性，并且似乎与某些血清型相关。例如，链球菌血清2型中烯醇化酶被认为是中枢神经系统侵袭的潜在毒力因子，因为它诱导白细胞介素-8释放。虽然烯醇化酶是糖酵解途径和原型兼职蛋白的一种酶，已被证明在几种支原体物种的细胞表面起粘附素的作用，但其在猪鼻支原体中的潜在兼职蛋白活性仍有待阐明。有趣的是，烯醇化酶也被认为在人抽搐症中发挥一定作用，并在桥本脑病中作为自身抗原。神经氨酸酶/唾液酸酶酶活性进一步被推荐为某些支原体物种（包括溶神经支原体、滑膜囊支原体和短吻鳄支原体）中中枢神经系统侵袭的潜在毒力因子。
尽管所有基因组测序的猪鼻支原体菌株都具有唾液酸清除和降解通路，但其穿过粘膜屏障并扩散和侵入浆膜、滑膜和中枢神经系统组织的潜力差异可能由其他支原体中尚未观察到的唾液酸酶活性的可变表达来解释。总而言之，导致猪鼻支原体脑部侵袭，并导致中枢神经系统疾病的因素和机制在很大程度上是难以捉摸的，并且仍然是推测性的。作为第一步，从不同身体部位分离的猪鼻支原体的比较基因组研究可能会深入了解组织的典型特征。
诱发因素可能进一步影响猪鼻支原体系统扩散的能力，从而侵入中枢神经系统。由于已知蓝耳病会促进链球菌败血症，蓝耳病也可能是猪鼻支原体的诱发因素。然而，目前没有研究明确表明蓝耳病是否增强了猪鼻支原体的全面传播，并且蓝耳病不太可能是猪鼻支原体侵入中枢神经系统的主要因素，而4号农场并没有蓝耳病发病表现，所以不太可能是蓝耳病起的作用。圆环病毒2型似乎在我们四例病例的发病机制中也没有发挥任何作用，因为我们从农场1的发现仅表明亚临床感染，而其他三个农场的仔猪对圆环病毒2型呈阴性。
结论
目前尚不清楚猪鼻支原体是否是新出现的中枢神经系统的入侵者，或者只是以前没有被调查过。后者似乎更有可能，因为它在50年前就从中枢神经系统被分离到但支原体诊断通常不针对脑脊液或脑膜拭子进行。该系列病例表明，猪鼻支原体可能不仅是中枢神经系统的入侵者，而且可能是引起猪脑膜炎的原因，尽管尚待实验性感染和猪鼻支原体组织学切片（如原位杂交或RNA范围）中检测到猪鼻支原体等方法来验证其中的因果关系。此外，由于目前的知识有限，需要对猪鼻支原体的发病机制和毒力因子进行基础研究。
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