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克隆是英文clone的英译词，最早用于园艺学，意为扦插，之后逐渐应用于动物学和医学方面，意思是和植物扦插相同的技术，即动物的无性繁殖技术。由于该技术的出现，促进了干细胞治疗技术的发展，改进了家畜扩繁方式，提供了濒危动物细胞冻存和复活的新方式，同时结合基因编辑技术，实现动物基因组的定点突变，加快了遗传改良，同时也可提供用于异种移植的器官。自1997年第一只克隆绵羊多莉出生后，克隆牛、猪、山羊等家相继出生，2000年欧洲盘羊的克隆成功标记着珍贵野生动物开始被克隆获得，实现了濒危动物的活体恢复。本文以克隆猪为例，对体细胞克隆技术、克隆猪性能评估、克隆猪生产应用、克隆动物的安全性评价以及应用意义进行介绍。
1、体细胞克隆技术
体细胞克隆技术又称为体细胞核移植技术，是动物细胞工程技术的常用手段，将体细胞核移入到去核的成熟卵母细胞内，得到重构胚胎，然后激活恢复其发育能力，将胚胎移植到代孕母畜体内后，获得与供体细胞基因完全一样的个体。由此可知，体细胞克隆技术是一种无性繁殖技术，和植物组培育种是相同的技术，因动物体细胞失去全能性，所以动物克隆技术流程更为复杂。
不同动物克隆流程基本一致，首次从供体动物上获取体细胞，一般获取耳皮成纤维细胞，培养细胞后可以将细胞放入液氮中长期保存，采用传统的显微操作技术或者手工克隆技术去掉成熟卵母细胞的核，然后将供体细胞与去核卵母细胞进行融合获得重构胚胎，将胚胎激活后移植到代孕母体内，足月发育分娩获得克隆动物。克隆猪生产流程见图1。
图1 克隆猪生产流程图
图2克隆仔猪
世界首例克隆猪于2000年由美国和日本获得，中国第一例克隆猪由中国农业大学于2005年获得，从此国内许多单位包括公司陆续研发获得克隆猪并应用。克隆技术在世界范围得到快速发展，也因此成立了许多商业化的公司，如澳大利亚Reinclonation 和 Clone International，美国Viagen/Trans Ova Genetics、Biosidus和Nuevo Milenium、阿根廷Goyaike、Geneal、In Vitro Brasil和Clonagem Animal，巴西Vitrogen YVF Biotech。国内有武汉科隆育种科技有限公司、河南创源生物技术有限公司，以及专注于宠物克隆的北京希诺谷和博雅秀岩。这些公司能生产大部分克隆动物，如Viagen公司在其官网介绍，已生产了数千头的克隆牛、猪、绵羊和山羊。
2、克隆猪的性能评估
克隆技术作为一种繁殖技术，在畜牧业中的应用主要是将育种群中特别优秀的种畜克隆出来，然后通过常规配种生产后代。克隆种畜能否在生产中应用，需要综合评估克隆动物的生长、健康以及繁殖性能。
克隆猪生长性能。克隆猪能否正常生长，是克隆应用的基础。北京畜牧兽医总站克隆了大白和杜洛克种公猪，在出生0和7d时，克隆仔猪的体重、体长、体高和胸围均与普通仔猪的测量结果无显著差异。日本静冈农科院比较了克隆杜金（杜洛克×金华猪）杂交猪和普通杜金猪，两者初生重没有差异，但是克隆猪3-7月龄生长速度要更快。日本茨城畜牧研究院克隆的长白母猪在生长发育方面与普通猪相比没有差异。以上研究说明克隆猪具有正常的生长性能，克隆仔猪见图2，同一窝的仔猪均健康生长。
克隆猪健康状况。目前主要通过克隆猪的血液生理生化指标来评估克隆猪的健康。北京市畜牧兽医总站采用自动生化分析仪对克隆大白和杜洛克猪12月龄和18月龄时的32项血液生化指标进行测定和分析，由结果可知克隆公猪与普通种公猪在生理状态方面基本相似，而且在代谢和免疫水平上表现出更优的状态。上海农业科学院将克隆巴马小型猪与普通巴马猪的生理生化指标进行比较，发现克隆巴马小型猪与普通猪的各项性能指标无显著差异。从以上报道可知，克隆猪和普通猪相比生理生化指标没有差异，证明克隆猪可以健康成长。
克隆母猪繁殖性能。作为种畜如果克隆猪繁殖存在问题，则根本没有应用价值，因此首例克隆猪出现的4年后，美国奥尔巴尼研究农场就将正常发情的克隆母猪进行配种，发现克隆母猪的妊娠天龄、平均产仔数和仔猪断奶重和非克隆猪相似，第二年美国北卡罗来纳州立大学也获得相同的结果。日本茨城畜牧研究院克隆的长白母猪及其后代母猪都表现出正常的繁殖性能。克隆母猪具有正常的发情，且产仔和克隆猪相同，证明其具有正常的繁殖性能。
克隆公猪繁殖性能。因采用人工授精技术，种公猪的基因覆盖更广，获得的后代更多，因此其价值更大，克隆种公猪能否产生的正常的精液意义更大。美国ViaGen公司克隆了12头公猪，发现克隆猪的精子密度、精液量、精子活动率、前向运动精子比例、畸形率方面和非克隆猪相比无显著差异；配种后，克隆猪与配母猪产总仔、活仔、死胎和木乃伊和非克隆猪无差异，此结果证明克隆公猪的繁殖能力与普通公猪相同。东北农业大学比较了克隆大白公猪和供体猪的精液品质各项指标，配种后比较两者与配母猪的受孕率、窝产仔数、产活仔数、断奶活仔数、仔猪初生重、仔猪断奶重和平均日增重等指标，结果显示克隆种公猪与供体猪在各检测指标之间均不存在显著差异，提示克隆种公猪与供体猪在繁殖性能和遗传性能上无显著差异，可以作为种公猪用于扩繁。国家生猪工程技术中心克隆了杜洛克和皮特兰种公猪，发现克隆猪具有正常精液质量和繁殖性能。地方猪方面，广西畜牧研究所克隆了巴马公猪，并与陆川猪进行杂交，与配母猪平均产仔头数、平均出生体重和断奶体重比原产巴马香猪的各项生产指标都高，广西大学克隆的巴马猪也获得了相同的结果。日本静冈农科院比较了克隆杜金杂交猪和普通杜金猪，发现两者首次采精天龄没有差异，均在11周就能采精，从5月龄开始，克隆猪的精液量显著高于普通猪，精子活力和精子畸形率无差异。以上报道说明，商品猪生产常用的皮特兰、杜洛克、长白、大白克隆猪均有正常的繁殖性能，因此可以在扩繁中应用，而地方猪不论纯种和杂交猪，也表现出正常的繁殖性能，证明通过克隆技术来保留优良地方品种基因是行之有效的。
3、克隆动物的安全性评估
美国食品和药物管理局 (FDA) 和欧洲食品安全局 (EFSA) 都对来自克隆动物的食品进行了全面的安全评估。FDA 于2008年发布了安全评估报告，详细调查了克隆流程、克隆及其后代的表观遗传、动物健康风险以及食物消费风险。同年EFSA 也发表了关于食品安全、动物健康和福利以及对环境的意见，为欧盟委员会就此问题提供了科学建议。FDA和EFSA的两项评估得出的结论是，就食品安全而言，克隆动物及其后代生产的肉、奶与传统饲养动物生产的没有区别。研究结果表明，与对照肉类和牛奶相比，克隆牛和猪及其后代的奶、肉在成分上没有差异。此外，动物克隆基本都用于种畜，因此克隆食品基本不会进入消费市场。
韩国中央大学做过一项分析，涵盖了2007-2017年关于克隆动物产品安全性的风险评估研究。通过分析大量的研究报告，包括美国和欧盟的报告，结论是没有证据表明来自克隆动物及其后代的肉或奶与非克隆动物的不同。此外综合大量的研究表明，没有证据表明克隆动物的肉和奶会构成食品安全风险，这与 FDA 和 EFSA 的评估是一致的。
4、克隆猪生产应用效果及经济效益
国家生猪工程技术中心克隆了特级杜洛克公猪用于纯种扩繁，经对比测定，克隆猪后代长速快、料肉比低、一致性高、选留率高，将克隆猪应用于商品猪生产，极大提高了商品猪经济效益。
克隆猪纯种扩繁生产F1代种猪，和非克隆猪同期测定，F1代生长速度加快8.34天、料肉比降低0.11，背膘薄1.93毫米，且一致性高，克隆F1代窝均选留比非克隆增加0.34头。将F1代杜洛克公猪配种二杂母猪生产F2代商品猪，和同期普通杜洛克后代商品猪相比，F2代商品猪出栏日龄缩短2.3天，上市均重增加1.3公斤、全程少消耗饲料2.32公斤、全程料肉比降低0.02，每头肉猪增加效益70元。
5、克隆猪生产应用注意事项
供体选择。供体选择是克隆猪生产和应用时最需重视但也是最容易忽略的问题，供体优劣关系着克隆猪生产应用效果，供体必须是自身性能优良且能稳定遗传的个体，因此供体选择不能只看自身表型，还要综合考虑供体的同胞、后裔、同血缘等性状表现，现在结合全基因选择技术可以使供体选择更为准确。只有基因是真正优秀的个体才能被选为克隆供体，这样克隆猪才能发挥其价值，因此必须有一定的育种群体并持续选育，才能获得基因优良的特级猪作为供体。
克隆猪表型。因克隆猪生产过程繁琐，操作步骤较多，易受环境影响，且克隆猪出生时体重有差异，导致相同供体的克隆猪生长表型会存在一定差异，但这些差异通过人工授精配种会消除，其后代的表型一致性较好。
6、克隆猪应用的意义
目前世界通用的种猪育繁体系是四个代次的金字塔形体系。第一代是曾祖代，也称之为核心群，主要通过测定选育优化种群遗传基因，不断提高种猪生产性能。第二代是祖代，纯种扩繁群体。第三代是父母代，是生产商品猪的主体，一般由祖代杂交生产。第四代是商品猪，是为消费者提供肉食的主体。曾祖代通过高强度的选育不断提高生产性能，其优秀基因也通过祖代扩繁、父母代生产逐渐传递给商品猪，从而使商品猪性能越来越优良。因为跨越不同的世代，优良基因从曾祖代传递到商品猪需要较长的时间。同时曾祖代性能虽然在逐年提高，但是在群体中总会出现一些特别优秀的种猪，其性状会远高于群体水平，如一些料肉比特别低、生长速度特别快的种猪，但这种类型的种猪数量特别少，数年才能筛选到一两头，因此生产的后代较少，优良基因覆盖面很窄。克隆就是将这些性能特别优良、数量较少的种猪大规模复制出来，既可以用于祖代纯繁生产，也可以作为终端父本直接生产商品猪，这样就缩短了优良基因的传递时间，同时又可以倍数级扩大优良基因的覆盖面，提高父母代种猪、商品猪生长性能和一致性，从而提高商品猪的经济价值。
石俊松
石俊松，高级畜牧师。现工作于武汉科隆育种有限公司，主要从事动物体细胞克隆技术研发和应用推广。参加国家转基因重大专项、“广东省重点领域研发计划”等20多项国家科研项目。获得科技奖励3项，发表SCI论文7篇，授权专利25项。
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