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意大利北部不同日龄的腹泻猪上轮状病毒A、B、C和H亚群的流行病学评估

天康制药 2022-11-25

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轮状病毒分为10个亚群(A至J),其中A群轮状病毒是人类和猪肠炎的主要原因。除A群轮状病毒外,关于人类和猪感染其它群轮状病毒的流行病学研究较少。目前,已经在猪中鉴定出五种亚群的轮状病毒(A,B,C,E 和H)。

世界范围内,有五个亚群轮状病毒(A群,B群,C群,E群和H群)已在猪群中发现,其中A群轮状病毒是最常见的,研究相对充分。他山之石,可以攻玉。由于我国猪群的轮状病毒各亚群的流行病学的公开数据不多,我们本期给大家分享2022年发表的一个意大利不同日龄的腹泻猪只中轮状病毒A群、B群、C群和H群的流行病学调查。其结论不一定可以直接适用于中国猪群 。但是,其揭示的规律有一定的借鉴意义。

 

本研究发现:

 

1、 在不同日龄段的猪群中,轮状病毒感染形式可分为单一感染或者混合感染。在哺乳猪中,以单一A群轮状病毒感染为主(57.9%,184/318)。在断奶猪中,以A群和C群轮状病毒混合感染为主(分别为64.4%和60.3%)。在育肥猪中,以A群,B群和C群轮状病毒混合感染为主(分别为51.4%,52.3%和55.1%)。

 

2、 断奶猪和育肥猪的轮状病毒感染率要高于哺乳猪。

 

3、 对于所有日龄段猪只,大肠杆菌是与轮状病毒感染最相关的病原体,但并非所有大肠杆菌菌株都具有致病性。

 

4、 不同日龄段猪群所感染的各轮状病毒亚群具有不同的季节性特点。哺乳猪,以A群轮状病毒为主。感染的高峰期在春季;断奶仔猪,以B群轮状病毒为主,感染高峰期在春季和秋季;育肥猪的轮状病毒感染率从春季到秋季是恒定的。

 

意大利北部不同日龄的腹泻猪上轮状病毒A、B、C和H亚群的流行病学评估

 

Assessing the Epidemiology of Rotavirus A, B, C and H in Diarrheic Pigs of Different Ages in Northern Italy

 

全文链接:

 

https://www.geenmedical.com/search?query=%7B%22keyword%22:%22Rotavirus%20and%20Diarrheic%20Pigs%22,%22sortType%22:1,%22pubDates%22:%5B2022%5D%7D&page=1

 

摘要

 

轮状病毒分为10个亚群(A至J),其中A群轮状病毒是人类和猪肠炎的主要原因。除A群轮状病毒外,关于人类和猪感染其它群轮状病毒的流行病学研究较少。目前,已经在猪中鉴定出五种亚群的轮状病毒(A,B,C,E 和H)。在本研究中,我们调查了不同日龄,不同季节和不同混合感染的患有肠炎的猪群中的A群,B群,C群和H群轮状病毒的感染率。建立了两种分子检测方法来区分A群,B群,C群和H群轮状病毒,对从患有急性肠炎的哺乳猪,断奶猪和育肥猪中收集的962份粪便标本进行了检测。总体而言,样本中检测到高比例的轮状病毒(78%),其中A群轮状病毒占比最高(53%),其次是C群(45%),B群(43%)和 H群(14%)。A群轮状病毒在哺乳猪(58%)和断奶猪(64%)中更常见,而B群,C群和H群轮状病毒经常在育肥猪中检测到。只有A群和B群轮状病毒感染有季节性感染的特点,并在不同日龄的猪只中存在差异。轮状病毒感染经常与其他病原体混感出现。本研究描述了猪群中各种轮状病毒亚群的多样性,确定了调查地区不同种类的轮状病毒感染的季节性和日龄特点。

 

关键词 

 

轮状病毒亚群;猪;肠炎;流行病学;肠道病原体

 

1、简介 

 

轮状病毒(群轮状病毒)是呼肠孤病毒科的成员,是无包膜病毒,直径约70 nm的三层衣壳包围了11个独立片段的双股正链RNA,在显微镜下观察它们通常表现为轮状颗粒。自20世纪70年代初发现以来,人们注意到,基于VP6介导的抗原反应性和凝胶电泳中11个基因组片段的迁移模式,存在不同的轮状病毒组。基于VP6基因序列,以及后来的全基因组测序,现在已经识别出10种不同的轮状病毒亚群或者种(A到J),它们在人类和动物宿主中分布不同。其中,已知A群、C群、E群、H群、I群和J群轮状病毒可感染哺乳动物,而A群轮状病毒是大多数(如果不是全部)哺乳动物宿主中的最常见亚群。A群轮状病毒是人类主要的肠道病原体,目前全球都在使用疫苗来预防儿童急性胃肠炎。已经报道了几种轮状病毒由动物传人的例子。2013年后,全球出现了一种马源性A群轮状病毒流行株,提醒人们轮状病毒具有人畜共患的可能性。

 

轮状病毒在世界各地的仔猪中也有描述。在猪场中,轮状病毒相关的肠道疾病是猪群发病和死亡的主要原因之一,导致相关的经济损失。目前,有五个亚群(A群,B群,C群,E群和H群)已在受肠炎影响的不同日龄的猪的粪便标本中鉴定出。A群轮状病毒是最常见的,在流行病学,遗传变异性和致病性方面都已被充分研究。A群轮状病毒主要感染哺乳仔猪,但最近的研究也表示断奶仔猪有很高的发病率,并且发现与肠炎的有、无不相关。在全世界爆发肠炎的猪群中,哺乳猪,断奶猪和断奶后的猪群中都检测到C群轮状病毒。在南美洲和北美洲(33%)以及日本(25.9%)有肠炎表现的猪中发现了B群轮状病毒感染。欧洲国家关于B群轮状病毒的流行病学数据很少。捷克共和国(0.6%),德国(1.6%)和西班牙(9.3%)的肠炎猪的B群轮状病毒感染率较低,而大日龄猪的感染率更高。B群轮状病毒是一个高度可变的群体,猪上已发现9种不同的VP6基因型。三十年前在英国的一个猪群中报道了E群轮状病毒,但在首次鉴定后,再未在其他地方报道过。此外,尚无有关E群轮状病毒的序列数据,这一曾经有过报道的轮状病毒仍有待确认。日本,美国(15%)和巴西(18%)的大日龄猪偶尔会出现H群轮状病毒感染。欧洲没有关于H群轮状病毒流行病学的数据。

 

尽管肠道疾病常与寒冷季节相关,但猪群轮状病毒感染没有表现出季节性,但有空间上、时间上的相关性,研究表明它们可能依赖于其他因素。此外,混合感染的存在使轮状病毒肠炎的流行病学变得复杂,其它肠道病原体可能会增加疾病的严重程度。特别是,在几项研究中已经描述了轮状病毒与流行性腹泻病毒,艰难梭菌,产气荚膜梭菌和大肠杆菌的共同感染。总体而言,猪的轮状病毒流行病学信息不完整,非A群轮状病毒的相关信息相对缺失,这是因为可用的诊断工具主要针对A群轮状病毒的。为了研究不同种类的猪轮状病毒的流行病学模式,我们开发了两种基于逆转录(RT)聚合酶链反应(PCR)的定量多重检测方法,用于同时检测A群、B群、C群和H群轮状病毒。然后,我们用这个定量RT-PCR方法分析了意大利北部地区被动监测期收集到的肠炎偶发和暴发猪只的粪便或肠道内容物。

 

2、结果 

 

2.1. 轮状病毒多重RT-qPCR检测方法的建立

 

设计、优化了A群,B群,C群和H群轮状病毒单独测定,并将其组合成两种多重RT-qPCR:A群-B群轮状病毒和C群-H群轮状病毒。

 

在我们的研究中设计的寡核苷酸的电子计算机分析,对存放在NCBI GenBank中的轮状病毒VP6猪序列进行,显示与A群轮状病毒 I5基因型完全匹配;B群轮状病毒 I11、I12和I13基因型;C群轮状病毒I1、I4、I5、I6、I7、I10、I11和I13基因型和H群轮状病毒I1基因型。通过构建A群、B群、C群和H群轮状病毒的四条单独标准曲线来评估分析的效率。回归分析表明,它们的效率非常匹配(R2>0.99),均高于95%(表1)。使用阳性对照样品的临界稀释液测试的灵敏度显示,显示所有目标的检测下限相当于每个反应102个拷贝。根据计算出的检测下限,将Cq截止值设置为37。这两种测定的特异性均通过RT-qPCR对15个不同于轮状病毒的猪肠道病原体分离物进行扩增而得到证实(补充表S1)。为了评估提取中是否存在污染物,以及RT-qPCR测定的可靠性,在每次运行中分析了阴性对照,无模板对照(NTC),内标(IC)和阳性对照。两种多重测定均成功扩增了阳性和内部对照,而空白对照和阴性对照均未观察到扩增曲线。

 

轮状病毒RT-qPCR测定的性能参数

 

2.2. 不同亚群轮状病毒在不同日龄段猪之间的分布

 

在2016年11月至2019年12月期间,78%(750/962)的提交标本呈轮状病毒阳性。A群轮状病毒检出率为56.8%,B群轮状病毒检出率为43%,C群轮状病毒检出率为45.3%,H群轮状病毒检出率为14.1%(补充表S2)。大多数轮状病毒阳性病例呈混合感染状态(60.7%,455/750)。在单一群轮状病毒感染(39.3%,295/750)中,A群轮状病毒占优势(17.2%),其次是C群(6.9%),B群(5.7%)和H群轮状病毒(0.9%)。为了按日龄段估计轮状病毒的分布,将样本分为哺乳猪、断奶猪和育肥猪(图1)。在哺乳猪中,A群轮状病毒最常见(57.9%,184/318),主要为单一感染(34.3%)。在断奶猪中,A群和C群轮状病毒更为普遍(分别为64.4%和60.3%),经常与其它群轮状病毒混合感染。混合感染占A群轮状病毒阳性样本的53.1%和C群轮状病毒阳性样本的52.7%。A群,B群和C群轮状病毒在育肥猪中平均分布(分别为51.4%,52.3%和55.1%),并且主要在混合感染中检测到。H群轮状病毒阳性病例随着日龄的增长而增加,从哺乳仔猪的3.1%到育肥猪的22%不等。有趣的是,大多数H群轮状病毒感染(93.4%,127/136)与其它群轮状病毒混感。如表2所示,轮状病毒组分布似乎受到日龄的影响。断奶猪轮状病毒感染率(84.5%)显著高于哺乳猪(72%,P=0.0005)。A群轮状病毒在断奶猪中占优势(64.4%),与育肥猪相比差异显著(51.4%,P=0.0012)。此外,育肥猪和断奶猪的B群和H群轮状病毒感染率高于哺乳猪(两项比较均P<0.0001)。断奶猪(60.3%)和育肥猪(55.1%)中的C群轮状病毒比乳猪(21.7%,两者均P<0.0001)更常见。考虑到轮状病毒以单一或混合感染的状态存在,哺乳仔猪中A群轮状病毒的感染率显著高于其它阶段猪群(P<0.0001)。相比之下,断奶和育肥猪中B群、C群和H群轮状病毒混合感染的数量高于哺乳猪(P<0.0001)。

 

以单一或混合感染的形式分布在哺乳猪(n=318)、断奶猪(n=239)和育肥猪(n=405)的A群,B群,C群和H群轮状病毒

图1. 以单一或混合感染的形式分布在哺乳猪(n=318)、断奶猪(n=239)和育肥猪(n=405)的A群,B群,C群和H群轮状病毒

 

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轮状病毒在不同日龄段猪只之间的季节分布

 

2.3. 轮状病毒在不同日龄段猪只之间的季节分布

 

由于研究期间(2016-2019)每个月的分析样本数量较少,因此所有群轮状病毒病例均按季节汇总。在哺乳猪,轮状病毒感染的高峰期出现在春季,而最低的病例数出现在夏季(图2)。在轮状病毒群中,A群轮状病毒表现出最明显的季节性,春季活动高峰(P<0.0001,表S3)。尽管在哺乳猪,轮状病毒感染率与肠炎数趋势一致,但在断奶和育肥猪,轮状病毒感染率与肠炎数不成比例(图2)。值得注意的是,在断奶仔猪中,只有B群轮状病毒表现出季节性分布,春季和秋季感染高峰(图2,表S3)。育肥猪的轮状病毒感染率从春季到秋季是恒定的。考虑到轮状病毒群的分布,与研究期间的剩余部分相比,冬季A群和B群轮状病毒的发病率较低。总之,我们的数据显示,所有日龄段的A群和B群轮状病毒都有明显的季节性波动,而C群和H群轮状病毒在整个研究期间更加分散。

 

 哺乳、断奶和育肥猪中不同亚群轮状病毒季节性感染模式

图2. 哺乳、断奶和育肥猪中不同亚群轮状病毒季节性感染模式。2016年12月至2019年11月检测的轮状病毒阳性病例(用条形图表示)按季节分组。冬季从12月到2月,春季从3月到5月,夏季从6月到8月,秋季从9月到11月。轮状病毒的感染率用线表示。

 

2.4. 轮状病毒与其它病原体的共同感染

 

根据日龄段(幼畜和成畜),结合轮状病毒感染研究了不同的病毒和细菌肠道病原体。分别对110头和41头哺乳仔猪和断奶仔猪进行了大肠杆菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌和流行性腹泻病毒分析,对163头育肥猪进行了大肠埃希菌、流行性腹泻病毒和导致大日龄猪胃肠炎的致病菌(猪痢疾短囊菌、毛状短囊菌和胞内劳氏菌)分析。表3总结了每个日龄段轮状病毒混合感染和单一感染的阳性样本数量。简而言之,在5.5%(6/110)的哺乳猪,14.6%(6/41)的断奶猪和1.4%(2/163)的育肥猪中检测到轮状病毒单一感染。相反,在哺乳猪68.2%(75/110),断奶猪63.4%(26/41)和育肥猪85.3%(139/163)中观察到轮状病毒混合感染。对于所有日龄段猪只,大肠杆菌是与轮状病毒感染最相关的病原体,但并非所有大肠杆菌菌株都具有致病性。在60%(66/110)的乳猪,41.5%(17/41)的断奶猪和81%(132/163)的育肥猪中检测到它的存在。

 

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3、讨论 

 

轮状病毒在患有肠病的猪中高度扩散,并与死亡率增加、生长障碍和经济损失有关。根据欧洲国家轮状病毒感染分布的数据来看,主要的B群,C群和H群轮状病毒很少或根本没有。

 

收集流行病学数据的一个主要限制是可靠诊断工具的可用性。虽然有几种直接诊断方法可用于检测A群轮状病毒抗原和RNA,但这不适用于非A群轮状病毒亚群。此外,轮状病毒(RVs)的高遗传变异性,以及B群和H群轮状病毒的基因组序列数量有限,可能会使引物和探针的开发非常困难。为了填补这些诊断空白,我们开发了两种多重RT-qPCR检测方法,用于特异性检测猪A群,B群,C群和H群轮状病毒。然而,由于A群,B群和H群轮状病毒的高序列变异性,并非公共数据库中描述的所有猪基因型都可以通过RT-qPCR测定来检测。这些分子测试用于筛选2016-2019年间从意大利猪群中收集的大量样本,这些样本来自不同日龄的有肠炎迹象的猪。一般来说,我们在78%的受肠炎影响的猪中发现了轮状病毒感染,断奶猪的病例数最多(85%)。事实上,在断奶阶段,仔猪更容易受到感染,因为其免疫系统容易受到应激因素(换料,断奶和环境变化)影响。尽管A群轮状病毒感染在断奶猪中更为常见,但A群轮状病毒单一感染主要在乳猪中检测到(34%),这表明A群轮状病毒感染在这个日龄段中起主要作用。与之前的观察结果不同,C群轮状病毒感染在哺乳仔猪中更常见,在我们的调查中,我们观察到断奶和育肥猪的感染率最高(分别为60%和55%)。在德国(1.6%),捷克共和国(0.6%)和西班牙(9.3%)的猪中检测到B群轮状病毒感染率低。有趣的是,在我们的研究中,B群轮状病毒病例的总体感染率(43%)高于其他欧洲国家调查,这表明在此期间和本研究调查的地点,B群轮状病毒感染率有所增加。然而,不能排除这种对比数据是由于B群轮状病毒的实际扩散的可能。必须考虑的是,B群轮状病毒是一个高度可变的群体,其中在猪中描述了9种不同的VP6基因型;因此,其检出率可能受到引物设计的影响。

 

这将需要进行大规模的结构化调查,并最终使用敏感和特定的诊断工具。此外,与其他研究一致,在我们的调查中,我们发现了大多数日龄较大猪只,如断奶猪和育肥猪的B群轮状病毒感染。在断奶猪和育肥猪中,B群轮状病毒的混合感染率显著增加,这表明B群轮状病毒可以作为大日龄猪肠炎的继发性病原。与其它群轮状病毒亚群相比,H群轮状病毒的检出率较低(14%),并且在日龄较大动物(断奶和育肥类)中更常见。与先前的研究一致,H群轮状病毒大多与其它轮状病毒群联合检测,强化它可能作为肠道机会病原体存在的假设。

 

有趣的是,在我们的调查中,观察到受肠炎影响的猪的A群轮状病毒和B群轮状病毒感染率的季节性影响,根据日龄段的不同,存在一些差异。值得注意的是,哺乳猪的A群轮状病毒在春季达到峰值,育肥猪的A群轮状病毒在春季和秋季达到两个峰值。同样,在断奶猪群中,B群轮状病毒在春季和秋季达到峰值,而在育肥猪中,B群轮状病毒在春季和秋季之间稳步增加。相比之下,C群轮状病毒和H群轮状病毒似乎没有受到季节变化的影响。有趣的是,在乳猪中,轮状病毒感染率与肠炎数量之间存在相关性,表明肠炎数量与轮状病毒感染率之间存在关联。相反,在断奶和育肥猪中,轮状病毒感染率与我们诊断实验室报告的肠炎数量不匹配,表明轮状病毒在大日龄猪的肠炎病因中起次要作用。先前研究发现 A群和C群轮状病毒的多年感染曲线中并没有出现任何季节性峰值。同样,2009年至2011年进行的一项多层次模型研究考虑了地理位置和日龄等影响因素,报告了A群轮状病毒和B群轮状病毒感染的波动。可能其它因素,如混合感染的存在,在不同季节和不同日龄段猪只中表现出与轮状病毒不一样的易感性。

 

由于肠炎可能是由多种肠道病原体引起或加剧的,因此我们还关注了混合感染的次数。先前的研究报道,低日龄仔猪的肠炎通常与单一病原体有关。相比之下,在本研究中,我们报道了低日龄猪只混合感染的比例较高(89%的乳猪和77.5%的断奶猪)。在混合感染中,轮状病毒的比例很高,育肥猪为85%,哺乳猪和断奶猪分别是68%和63%。这些数据表明,特别是在大日龄猪中,肠道疾病可能是病原体混感的结果。总的来说,大肠杆菌是在所有日龄段猪只中与轮状病毒最相关的病原体,然而大肠杆菌的致病性仅在少数样本中检测到,阻碍了对其在感染中作用的判断。

 

轮状病毒可能在断奶猪肠炎的病因起主要作用,断奶猪的轮状病毒单一感染的比例较高(断奶猪14.6%,哺乳仔猪为5.5%,肥育猪为1.2%)。然而,值得考虑的是,本分析中未包括的其它病毒和细菌肠道生物(即星形病毒,小核糖核酸病毒,杯状病毒,细小病毒等)最终可能会干扰和困扰观察到的情况。尽管如此,这项研究展示了流行病学情况的可变性和复杂性。该研究不能用于分析轮状病毒在疾病病因学中的特定作用。基于被动监测,我们调查的一个局限无疑是缺乏健康动物的对照组。应进行包括病例对照组在内的研究,以便于正确的分析肠炎,轮状病毒和混合感染之间的关联。

 

总之,本研究报告了意大利受肠道疾病影响的猪群中不同亚群轮状病毒的高感染率。观察到不同日龄段猪只、不同亚群轮状病毒群之间的感染率存在差异,已经A群和B群轮状病毒有季节性感染的特点。B群,C群和H群轮状病毒的高检出率表明,非A群轮状病毒种也可能在猪肠炎的病因中起重要作用。对非A群轮状病毒导致的猪肠炎的更好地诊断有助于更好地理解它们的危害,并最终制定行之有效的控制策略。

 

4、材料和方法 

 

4.1. 样品

 

2016年11月至2019年12月,兽医或农户提交了不同日龄猪的粪便和小肠,以确定意大利猪群肠炎病例的病原体。对962个标本进行了轮状病毒筛查。样本按哺乳仔猪(<8千克体重),断奶仔猪(8-25千克体重)和育肥猪(>25千克体重)的日龄分类。将收集的样品放在最低必需培养基(MEM)中以1:10(w/v)比例稀释,并通过涡旋匀浆。通过离心10分钟使悬浮液澄清4.000× g,以清除碎屑。接下来,使用商业试剂盒(NucleoMag® Vet kit, Macherey-Nagel, Düren, Germany),将200µL上清液用于RNA提取,按照制造商的说明进行。

 

4.2. 定量RT-qPCR检测轮状病毒

 

基于NCBI GeneBank数据库中的猪A群、B群、C群和H群轮状病毒的VP6序列来设计RT-qPCR引物和水解探针。A群、B群和H群轮状病毒(而不是C群轮状病毒的寡核苷酸)含有退化的核苷酸,以允许检测大量轮状病毒序列。使用表4中报道的引物和探针开发了两种多重RT-qPCR测定法,用于同时检测A群/B群轮状病毒和C群/H群轮状病毒。使用商业QuantiFast 病原体 RT-qPCR试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)以“一步法”进行RT-qPCR测定。将制造商提供的外源内部对照 RNA(IC)和特异性检测测定法添加到每个RT-qPCR反应中,以验证不存在抑制剂。简言之,将6µL提取的RNA添加到2.5 µM的RVA、RVB引物(A群-B群测定)或2.5µM C群轮状病毒引物和3.75µM H群轮状病毒引物(C群-H群测定)中,最终体积为10µL。然后在95℃下对每个混合物进行变性,且持续5分钟。接下来,将5µL变性混合物添加到20µL RT反应混合物中,该混合物按照制造商的说明制备。RNA在50◦C条件下持续20分钟,进行反转录。然后,在95℃条件下,进行一个Taq聚合酶激活周期,持续5分钟。扩增作45个周期,分别在95◦C持续15秒和60◦C持续30s。使用CFX96 触屏实时PCR检测系统(Bio-Rad Laboratories,Hercules,California,USA)进行RT-qPCR测定,并使用Bio-Rad CFX Manager 3.1软件的单阈值方法分析数据,主要用于Cq测定。当“无模板对照”(NTC)和阴性对照的Cq不可确定或>40时,接受实验,样品的内标(IC)小于34,阳性对照范围在28至33 Cq之间。

 

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4.3. 轮状病毒 RT-qPCR性能

 

多重RT-qPCR测定的检测下限(LOD)是通过以已知的基因组拷贝滴度测试RVA-、RVB-、RVC-和RVH-阳性样品的6个10倍连续稀释的重复物来确定的,从初始浓度104开始,到最终浓度10个基因拷贝/反应。LOD被计算为在所有六个重复中可以检测到的最低RNA浓度。这两种测定的特异性是通过RT-qPCR分析一组由15种引起猪肠炎的猪病毒和细菌分离株来确定的。克隆A群,B群,C群和H群轮状病毒VP6的特异性基因片段,通过分光光度计(Infinite®200 NanoQuant,Tecan,Männedorf,Switzerland)进行体外转录和定量。对A-B群轮状病毒和C-H群轮状病毒进行RT-qPCR测定,将这些转录本(107至103个反应基因组拷贝)进行连续稀释,以生成标准曲线,并确定反应的效率和线性相关指数(R2)。

 

4.4. 细菌和病毒剂检测

 

还测试了粪便和肠道样品相关的病原微生物,如猪流行性肠炎病毒(PEDV),大肠杆菌,产气荚膜梭菌,艰难梭菌,细胞内劳森氏菌,毛状短螺旋体和猪短螺旋体。如前所述,一般使用RT-qPCR检测PEDV。大肠杆菌和产气荚膜梭菌以直接培养的方法进行检测,该样品在厌氧环境中于37◦C 24小时培养(5%羊血哥伦比亚琼脂),然后待检测。通过标准表型特征(包括分析轮廓指数系统)进行鉴定。艰难梭菌以直接培养的方法来,盲肠内容物在用95%乙醇按1:1(w/v)比例处理30分钟后,在厌氧条件下,用5%羊血哥伦比亚琼脂培养细菌48小时,然后待检测。为了检测胞内劳森氏菌,冷冻肠管用研钵和研杵匀浆,而粪便通过涡旋匀浆,然后将粪便和肠道样品用PBS1X 按1:10(w/v)比例稀释。根据制造商的说明,通过DNeasy®血液和组织试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)提取DNA。如先前发表的方法所述,通过巢式PCR测定分析提取的DNA。Brachyspira ssp公司。通过在厌氧环境中使用对特定抗生素(利福平、万古霉素和粘菌素)敏感的选择性培养基(Brachspira琼脂)直接培养5天来检测。然后,在先前工作的基础上,将细菌菌落转移至多重实时PCR方法进行同时鉴定。

 

4.5. 统计分析

 

当样本量小于10时,使用二项式模型或Clopper-Pearson方法计算每个日龄段的轮状病毒感染率和95%置信区间。当样本量小于5时,通过χ2检验或Fisher精确检验分析轮状病毒与日龄段之间的关联。还计算了整个研究期间每个季节的群轮状病毒感染率,其中冬季为12月至2月,春季为3月至5月,夏季为6月至8月,秋季为9月至11月。轮状病毒病例与季节之间的关联通过χ2检验计算。使用R软件3.6.1版,假设显著性水平为5%,进行所有统计分析。

 

译者简介 

 

赵丰

赵丰

研究生

 

毕业沈阳农业大学,畜牧专业,研究生。曾在正大集团猪场从事猪只管理等工作,以及在客户猪场解决过猪流行性腹泻和口蹄疫疾病。


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