口蹄疫抗体检测的必要性和注意事项

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一种高度接触性，主要在偶蹄动物之间传播的烈性传染动物疫病，也能感染部分非偶蹄动物，如老鼠和大象，据统计对口蹄疫易感的动物有70余种，但常见的易感动物主要有猪、牛、羊、鹿、骆驼等，其临床特征为口腔黏膜、蹄部和乳房等部位发生水疱。口蹄疫病毒有7个血清型，分别是：O型、A型、C型、南非1型（SAT-1）、南非2型（SAT-2）、南非3型（SAT-3）和亚洲1型（Asia 1），每个血清还有不同的亚型，不同血清型之间不存在交叉保护作用。

目前，我国口蹄疫以O型多毒株同时流行为主，但不排除A型口蹄疫点状发生的可能性，并且境外毒株传入我国的风险仍然存在，我国口蹄疫的防控压力依然很大。在《国家动物疫病强制免疫指导意见（2022-2025年）》中要求“对全国有关畜种，根据当地实际情况，在科学评估的基础上选择适宜疫苗，进行O型和(或)A型口蹄疫免疫:对全国所有牛、羊、骆驼、鹿进行O型和A型口蹄疫免疫；对全国所有猪进行O型口蹄疫免疫，各地根据评估结果确定是否对猪实施A型口蹄疫免疫。”为了解疫苗免疫效果，及时要对免疫后的畜群进行抗体水平监测，《2022年国家动物疫病免疫技术指南》中指出“猪免疫口蹄疫疫苗28天后，其他家畜免疫21天后，免疫合格个体数量占免疫群体总数不低于70％的，可判定为群体免疫合格。”

本文将对口蹄疫免疫抗体水平检测的必要性进行分析，并对检测过程中的注意事项进行阐述，旨在为广大养殖户在疫苗免疫方面提供技术支撑。

一、口蹄疫抗体检测的必要性

01、利于口蹄疫疫苗免疫效果评价

口蹄疫疫苗的免疫效果是疫苗有效性的重要体现，其常见的评价方法有动物攻毒试验和免疫抗体检测等。其中，因攻毒试验需要在一定级别生物安全条件下进行，所以免疫抗体检测是目前评价抗体水平最为便捷、实用的一种手段。口蹄疫抗体的检测不仅可以定量还可以定性，例如用液相阻断ELISA进行抗体检测牛、羊等反刍动物抗体效价>27，猪抗体效价>26为合格；用固相竞争ELISA检测口蹄疫抗体效价>26为合格，当畜群体内抗体合格后可有效抵抗口蹄疫病毒的侵害。所以通过抗体水平的检测可以了解和掌握免疫前抗体水平，与免疫后的抗体作对比分析，评价口蹄疫疫苗的免疫效果。

02、避免猪群出现免疫空白期

免疫空白期就是抗体没有达到保护水平的时期。仔畜的免疫空白期主要出现在母源抗体降至不能抵抗口蹄疫病毒感染的时期，以及在初次免疫50天之后与再次免疫之间。免疫口蹄疫疫苗后对畜群的保护是有一定期限的，对于成年牲畜免疫空白期主要出现在两次疫苗接种之间，当两次免疫之间的时间间隔超过了疫苗的免疫保护期就会出现免疫空白期。但是由于牲畜的个体差异如品种、日龄、性别、健康状况以及营养状况等，均会导致牲畜免疫空白期出现的时间不同。而了解免疫空白期的手段就是通过定期做抗体检测，了解牲畜口蹄疫抗体水平消长规律，对于抗体水平较低的畜群适时进行加强免疫，并优化免疫程序，确保畜群在养殖生产过程中不受口蹄疫病毒的侵害。所以建议种畜间隔四个月进行一次检测，商品牲畜一年分上下半年进行两次检测。

03、监测免疫密度提高群体免疫保护力

对于口蹄疫群体免疫密度应常年保持在90%以上,其中应免畜免疫密度应达到100%，免疫抗体合格率应常年保持在70%以上。通过口蹄疫抗体水平检测可以查漏补缺确保群体免疫密度达标，当群体免疫密度达标时畜群就会形成群体免疫保护力。畜群具有免疫保护力时即便在养殖场周围存在疫情或者畜群内存在零星感染的动物，已免疫的群体仍然会受到很好的保护，疫情并不会在畜群内蔓延。

04、鉴别隐性感染了解场内污染状况

如果畜群没有接种口蹄疫疫苗，而处于隐性感染的动物会检测口蹄疫抗体水平很高，此时可以诊断为口蹄疫病毒感染。此外检测抗体水平还可以准确掌握疾病在猪场的污染状况，当免疫抗体水平偏低和整齐度差时，可推测场内是否存在其他疾病、免疫程序不合理或管理不善等情况，并制定相应的控制策略。

二、口蹄疫抗体水平检测的注意事项

01、试剂盒的选择

口蹄疫抗体检测方法在《2022年国家动物疫病免疫技术指南》中推荐了三种方法。第一种是液相阻断ELISA，当牛、羊等反刍动物抗体效价>27，猪抗体效价≥26时即可判断为抗体阳性。第二种是固相竞争ELISA，抗体效价>26方可判断为阳性。第三种是VP1结构蛋白抗体ELISA，按照方法或试剂使用说明判定为阳性。在以上三种方法中口蹄疫液相阻断ELISA是被国际粮农组织（FAO）、世界卫生组织、国家农业农村部所推荐的，具有良好的敏感性和可重复性。该方法可检测口蹄疫全病毒灭活疫苗抗体，由于技术的不断改进，不仅快速并且可以准确的检测出抗体滴度。

02、样品的采集和运输

抗体是一种蛋白质，其血清质量对检测有一定的影响，只有严格做好样品质量控制，才能确保检测结果的准确性。

（1）采集

对于样品的采集最好用采血管进行采集，尽量不要用注射器进行采血，以免发生机械性溶血；若因环境需要用注射器进行采血，可以在采血后将血转移到采血管内静置后离心获取血清。猪的采集部位优先选择前腔静脉；牛的采血部位可以在颈外静脉和牛尾静脉；羊的采血部位可以在颈静脉。此外，为了避免样品混淆，将样品进行编号。

（2）运输

因一些养殖场不具备检测条件，需要借助第三方检测机构来进行评估抗体水平，而在运输过程中，较高的环境温度和较长运输时间等因素都可能使样品的质量发生变化，影响检测结果。通常采用内含冰袋泡沫箱进行储存运输，据研究结果表明泡沫箱内温度变化与外界温度密切相关，箱内血样抗体效价会因温度变化缓慢下降，并且运输过程中存在暴力运输，极易发生泡沫箱破裂，储存温度变化大，所以在运输的过程中尽量保持样品存储温度在4℃左右，且要选择较快的运输方式，因为，泡沫箱内4℃下放置24h后获得的检测结果误差最小。

03、检测注意事项

液相阻断ELISA是一种广泛用于口蹄疫抗体检测的方法，下面以该方法为例说明注意事项。

（1）外部因素

实验应选择25℃±2℃环境下进行，试剂盒要提前平衡至室温。对于实验过程中所用到的培养箱（37℃）、酶标仪和移液枪最好提前进行校准和调节。实验用水应使用检测合格的纯水或蒸馏水，不能使用在容器内存放时间过长的纯水或蒸馏水。

（2）抗原的保存

标准抗原需要在-20℃下冻存，可以预先将抗原进行分装后冻存分批使用，但是要注意抗原不可反复冻融，以免抗原被污染或损失，导致检测结果出现误差。

（3）准确稀释血清

因为猪血清稀释梯度和牛羊血清稀释梯度不相同，在血清稀释的时候首先要确定血清的来源。稀释同种动物血清的时候，一定要保证将血清加入稀释液内，尽量减少残留，加入血清后要将血清和稀释液混匀。

（4）避免“跳孔”

在样品比较多的时候会出现“跳孔”现象，导致稀释系列中某一孔的OD450nm值突然增高，这主要是因为在洗孔的过程中洗涤次数不够或漏洗，还有就是在人工洗板后在拍板的时候造成了交叉污染。

（5）底物的混合

在检测过程中当加完底物的时会出现不显色的现象，主要原因是未将底物A/B液进行充分混匀；在加底物的时候先加底物A溶液，再加底物B溶液；A/B液保存时长期不避光导致底物失效。

（6）避免抗原对照OD450nm值偏高或偏低

当酶标板颜色过深时，抗原对照的OD450nm值会在3.0以上，造成这种结果主要有以下几种原因①配置底物时间过长或者在操作过程中被污染；②在实验操作过程中环境温度过高；③孵育时间过长；④酶标抗体洗涤不彻底。

OD450nm值整体偏低（包括抗原对照OD450nm值偏低）其原因主要是在实验前未将试剂盒平衡至室温或因酶标仪参数设置不正确，在加完终止液后出现明显的黄色但OD450nm值很低。

（7）预防“边缘效应”

“边缘效应”主要是指由于酶标板在培养箱内加热反应时，边缘孔升温速度过快造成OD450nm值偏高的一种现象。若在实际检测过程中出现此种情况，只要两孔之间OD450nm值最高不超过0.2，则对抗体效价的判定不会造成影响。所以为了避免或减少这种现象的发生，对于培养箱需要提前预热，在培养箱内加热反应的时候应将反应板平铺在培养箱中央，不可将其叠摞在一起。

（8）确保阳性对照成立

一般造成阳性对照不成立的原因有①阳性对照在使用过程中因保存或使用不当发生降解；②在稀释阳性对照的过程中存在误差；③抗原稀释比例不正确；④抗原保存环境温度不适宜，使抗原发生了降解。

（9）样品质量不好易出现假阳/阴性

检验过程中避免出现假阳性的方法是①样品送检的过程中避免溶血；②若送检的样品是全血，加样时不可将血浆加入；③血清应避免细菌污染；④有时因动物个体差异会出现假阳性。

减少出现假阴性的方法是应避免采集免疫初期牲畜的血清，因此时血清中的抗体水平还没有上升到最高点，此外样品在运输或保存过程中应避免腐败，以免发生抗体损失的现象。

（10）未免疫动物检测

对于未免疫的初生仔畜检测其抗体目的是为了了解母源抗体的消长情况，从而确定最佳的首免时间。若是其它日龄未免疫口蹄疫疫苗的动物抗体检测结果为阳性，可以结合病原学检测或临床表现进一步确定是否发生感染。

（11）提高复检符合率

对于提高复检符合率方法是首先要保证操作的一致性，确保同一人员操作，加样量前后一致；不同批次的口蹄疫抗体检测试剂盒不可混用，以及单次检测样品数量避免过多。