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如何应用基因编辑技术,快速精准检测非洲猪瘟病毒?

养猪信息网2019-07-19 09:03:27

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核酸检测已开发出了不少检测方法,在这些方法中选择最快速简便、准确、廉价的检测方法,是未来猪业的发展方向!
  核酸检测已开发出了不少检测方法,但如何更加快速、简便、准确、廉价的检测,是未来的发展方向。
  
  2017年,张锋等利用CRISPR-Cas13a具有 collateral effect的特点建立了快速核酸探测的方法,即Cas13a结合特异性靶标RNA后随即切割其他RNA(这里设计成RNA荧光报告系统),与等温扩增技术recombinasepolymerase amplification(RPA)相结合,把这种检测方法称为SHERLOCK(SpecificHigh Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing)。这种方法适用于RNA病毒检测。特点:37 ℃恒温扩增,简单方便,可在猪场检测,可做试纸条。

基因编辑技术
 
  针对DNA 的检测,待检靶标核酸分子经过扩增后得到靶标DNA、向导RNA和Cas12a蛋白形成三元复合体时,该复合物会切割体系中其它的单链DNA分子。向检测体系中加入crRNA和Cas12a蛋白;当靶标DNA存在时,Cas12a与crRNA以及靶标DNA形成三元复合体,同时该复合物行使其trans切割的活性并切割带荧光信号标记的单链DNA (两头分别连有发光基团和淬灭基团,被切断后发光基团可以发光) ,从而发出荧光。因此,通过检测荧光即可得知待检测体系中是否含有靶标DNA分子。这种方法适用于DNA病毒检测。特点:先进行PCR扩增,约45min;再用Cas12a检测荧光,15min;共计1h左右。非洲猪瘟病毒属于DNA病毒,可用CRISPR/Cas12a方法检测。

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  张锋,美国麻省理工学院史上最年轻华人终身教授,被视为诺贝尔奖的热门人选之一
  
  实验设计
  
  Strategy 1: utilizing Cas13ato detect the target nucleotide

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  Strategy2: utilizing Cas12a (Cpf1) to detect the targetnucleotide

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  基于CRISPR-Cas12a技术ASFV检测方案
  
  1. 需要材料
  
  Cas12a蛋白,crRNA,NEBbuffer3.1,SterileH2O,ssDNAreporter,ASFV的PCR引物,RNaseinhibitor,384孔定量PCR板,200μl的PCR管,以上材料由实验室提供;待测样品(血清、体液等),TaqPCR StarMix,病毒DNA提取试剂盒。
  
  2. 仪器
  
  恒温水浴锅或恒温生化培养箱,荧光酶标仪(带有485nm和535nm荧光检测器)。
  
  3. 检测方法
  
  针对猪血清样本的快速检测流程如下:

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  检测体系见下表:

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  将上述组分在PCR管中混匀,加入384孔板中,封膜,避光,放入37℃恒温生化培养箱或恒温水浴锅中,反应1小时后,用荧光酶标仪读取荧光值,其检测条件为λex:485 nm; λ em: 535 nm。
  
  基因编辑技术 VS 荧光定量PCR(qPCR)

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  基因编辑技术除了检测病毒核酸,还可用于以下检测
 
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