同样是做精准剔除，为何有的猪场做得很好，而有的却不成功，甚至整个猪场的生猪都剔没了？
华中农业大学教授赵俊龙表示，影响精准剔除的最关键因素是正确及时的诊断，其次是执行力和周边环境条件，此外还包括其他生物安全措施。
5月16日，礼蓝动保“防亦有道·道出实效”系列技术线上讲座再次开讲，本期邀请华中农业大学教授赵俊龙分享《非洲猪瘟精准剔除成功的关键——诊断及时与准确》。本栏目由《农财视频》全程直播。
诊断、执行力和环境是影响精准剔除的因素
防控非洲猪瘟，做好精准剔除十分重要。赵俊龙表示，影响精准剔除的最关键因素是正确及时的诊断，其次是执行力和周边环境条件，此外还包括其他生物安全措施。
其中，诊断与检测包括临床诊断、病理学诊断、鉴别诊断和实验室检测技术。
赵俊龙介绍，可以从猪只的临床表现判断是非洲猪瘟急性型、亚急性型或慢性型。非洲猪瘟急性型的猪只体温40-42°C，死亡率90%-100%，呈现厌食、不愿活动。皮肤发红、呕吐、鼻腔出血、血便、便秘等。妊娠母猪流产；非洲猪瘟亚急性型的猪只出现中度发热，食欲下降。皮肤出血和水肿，感染后 7-20 天死亡，病死率为 30%-70% ；而慢性型猪只则表现为病猪体重下降、生长不良，呈现间歇热，耳部、腹部和大腿内侧皮肤发生坏死或溃疡，关节肿大，感染猪可出现呼吸道症状等。
病理学剖检可看到网状内皮系统被损害。赵俊龙强调，科研机构可以做这方面的工作，不提倡猪场私自做病理学诊断。
非洲猪瘟的亚急性与慢性型症状容易与其他猪病混淆，所以要做好鉴别诊断。
建议检测病原学用PCR，血清学用ELISA
赵俊龙介绍，实验室检测方法有很多，如病原学检测方法有病毒分离鉴定；普通和荧光定量PCR（常用）；非洲猪瘟病毒的分离；HAD(血凝实验)；LAMP（等温扩增）；胶体金；FAT（免疫荧光抗体）；夹心法ELISA检测抗原等。
血清学检测方法有间接免疫荧光（IFA）；ELISA（常用） 和免疫印迹试验（IBT）等。
赵俊龙表示，病毒分离主要使用PAM（猪肺泡巨噬细胞）或者PBM（猪骨髓巨噬细胞）原代细胞；只有少数毒株可以在Vero细胞生长，目前缺乏可靠的传代细胞系，也是未来非瘟疫苗的大规模生产的瓶颈。
病原学检测应该采哪些部位比较好呢？赵俊龙介绍，非洲猪瘟攻毒猪病毒检测的敏感性依次为：血液>口腔拭子>肛门拭子。接触感染猪病毒检测的敏感性：口腔拭子>血液≈肛门拭子。组织病毒含量：脾>肝>淋巴结>心脏≈结肠；攻毒猪>阴性接触猪。生存时间：攻毒感染猪6-9天；阴性接触猪13-14天左右。
赵俊龙总结，病原学检测可以用普通PCR和荧光定量PCR的方法，血清学方法中推荐使用ELISA抗体检测。IB（免疫印迹法）,IFA（免疫荧光抗体）和IPT（间接免疫过氧化物酶检验）是非洲猪瘟病毒确诊的金标准。可以用血清学方法检测耐过猪。
对于荧光定量PCR与抗体检测分析，赵俊龙介绍，急性感染猪的CT值一般在20以下，猪只快速死亡，症状明显，抗体滴度低，无抗体。亚急性感染的CT值在20-25左右，存活时间一个月左右，临床评分波动上升，在约10-14天后抗体出现，滴度逐步升高；慢性感染的CT始终在30-40间，波动下降，最后为阴性；34-38天后临床症状消失，表现健康；抗体滴度始终维持在高位。
试剂盒、采样方法和部位等因素影响检测结果
影响分子生物学检测结果的因素有很多，赵俊龙表示，一是商品化试剂盒或自配体系的质量（引物、酶、反应体系）。体系与特异性、敏感性、操作性、稳定性、质量控制相关。
二是采样方法、采样部位、采样时机和样品的保存运输与处理。（1）发现可疑症状，第一时间采样送检（采样优先顺序：鼻腔拭子>唾液>阴门拭子>肛门拭子）。（2）血液采集：不含抗凝剂的采血管（红色盖子）或者含EDTA的抗凝剂采血管（蓝色盖子）或者使用棉签采集血液（推荐使用），操作简便，应激小；随后4度以下保存或者加冰邮寄。（3）血清样品在分离后可以立即开展检测。如果需要储存，则对于抗体检测需储存在-20℃；对于病毒检测，最好储存于-80℃。
赵俊龙介绍，环境采集以区块为单位，对风险等级进行区域采样。建议不要安排消毒人员自己采样。生产区内采集，包括墙体、地面、风机、地沟、设备、水线、料线等。其他死角、料槽底部等不易采集到的位置都需要注意。生产区外包括出猪台、场区大门、料塔、下水道、员工宿舍、储物间、浴室、办公室、餐厅厨房、车辆、水源等所有可能受到污染的区域。他介绍，样品在4℃保存。采样材料用棉签或纱布，更推荐使用棉签。
三是核酸提取有机溶剂、柱提法、磁珠法，但现在大多数实验室都用后两者；四是人员操作的规范性、科学性和熟练度；五是实验室管理，尤其是对交叉污染的预防和处理。以及与人员、流程、风向有关；六是仪器设备的质量，荧光PCR仪和试剂盒的匹配性。
检测技术应用十分广泛，赵俊龙介绍，在精准剔除方面，除了诊断准确以外，更重要的是确定范围，这完全取决于猪场现场实际情况。对于病毒猪，建议在原位处死（电击、安乐死等）后，用密封塑料袋封装再运走，然后对周边环境进行火焰消毒，再用消毒液进行消毒。他强调，在操作过程中要保护好个人，穿戴防护服。
检测技术还可用于复产环境的检测。赵俊龙表示，料槽，栏杆，粪沟，漏粪板，风机水帘，饮水器，门窗，料线的阳性污染可能性较大。生活区环境中，员工宿舍，门卫室，生活区仓库是重点防控区。
此外，检测技术应用于耐过猪的筛选与监测；蚊虫、苍蝇、软蜱、鸟、蚂蟥等传播媒介的检测和饲料和饲料原料的检测。
问答环节：
1、非洲猪瘟疫苗的研究进展情况如何？
赵俊龙：灭活疫苗与病毒载体疫苗都不太理想，科学家们开始研究弱毒活疫苗。弱毒活疫苗最大的优点是免疫原性强，保护力效果好。但缺点是弱毒株长期存在，难以净化，同时基因变异突变风险高，可能毒力返强。
自然弱毒株疫苗的保护力好，但存在返强；基因修饰弱毒株对同源性毒株保护力好，但异源性保护较差。我国的减毒活疫苗是缺失CD2V和MGF基因，当前疫苗处于临床实验当中，待临床实验观察后再申请安全评价，和新兽药证书。
据介绍，我国的双基因缺失疫苗保护力100%，但重组可能性有多少，副作用有多少，还在实验中。
2、非洲猪瘟耐过猪带毒情况如何？
赵俊龙：目前临床上非洲猪瘟亚急性型病毒猪与耐过猪越来越多，实际上，耐过猪受到应激还是会传播病毒。如果猪场要做非洲猪瘟净化，以及有能力尽快恢复生产的话，建议淘汰耐过猪；如果猪场耐过猪占多数，不想浪费每一头猪的经济效益的话，也可以继续生产。
3、请问苍蝇是否可以传播非洲猪瘟病毒？
赵俊龙：非瘟病毒能在苍蝇等媒介中存活多长时间，我们还没做这方面的实验。但可以肯定的是，苍蝇可以通过机械传播，且吸血苍蝇传播距离较远。
4、请问复产成功率是多少？
赵俊龙：中国整体的复产成功率和自己猪场的复产成功是没有关系的。复产成功与空场时间长短没有直接关系，复养成功的关键是猪场环境消毒到位（通过实验室检测）；其次是引进猪只要头头检测，耐过带毒猪生产的仔猪可能也会带毒，建议做病原检测和血清抗体检测；最后，做好复养的生物安全、饲料安全和饮水安全等。
