广告
轮状病毒（Rotavirus，RV）是经口传播的致病微生物，可感染人类和多种动物，导致肠道疾病。猪轮状病毒（Porcine rotavirus，PoRV）对猪群中的危害尤其严重，特别是对幼龄个体，主要侵犯小肠上皮组织，引发腹泻症状。在生猪养殖业中，PoRV对环境抵抗力强，在粪污中不易失活，传播能力强，加之基因不断重组并可能引起跨物种传播。一旦发生疫情，可能造成显著的经济损失。养殖场需要采取针对性的预防和控制措施，有效遏制PoRV传播。因此，对PoRV流行情况的持续性检测，一方面可为PoRV的防控提供参考，另一方面也具有一定的公共卫生意义。
1 病例情况
2023年12月，广东某生猪养殖场断奶前后的仔猪出现腹泻、脱水和消瘦等症状，猪场未免疫轮状病毒疫苗，仔猪病死率高达70%。患猪死亡后，表现为皮肤干燥、眼窝凹陷。尸检可见死猪全身淋巴结充血、淤血；肠腔积气、积液，肠壁变薄（图1）；肠道内积存多量内容物，含有大量泡沫和凝乳块。
图1 病死猪眼观剖检病变
2 材料与方法
2.1 病料
广东省肇庆市某猪场送检的粪便样品4份、腹泻病死仔猪1头。
2.2 主要试剂
兔血琼脂培养基和普通营养琼脂培养基购自北京克必隆分子诊断技术有限公司，FastPure Viral DNA/RNA Mini Kit Pro，HiScript II One Step RT-PCR Kit（Dye Plus）均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，DL-2000 Marker购自宝日医生物技术（北京）有限公司。
2.3 细菌分离鉴定
在超净工作台中利用已消毒过的手术刀切开感染死亡猪只的肠道深层组织，用一次性无菌塑料接种环蘸取少量组织液，将其涂抹在兔血琼脂平板和普通营养琼脂平板。将培养基倒置于37℃恒温箱内培养24～48 h后，观察培养基表面是否出现疑似大肠杆菌和链球菌菌落。
2.4 病毒RT-PCR检测
取病料样品与磷酸缓冲液（PBS）进行混合，反复冻融3次后8 000 g/min离心5 min，取上清液用FastPure Viral DNA/RNA Mini Kit Pro试剂盒提取核酸，应用HiScript II One Step RT-PCR Kit（Dye Plus）试剂盒对PoRV进行检测。反应体系（50 μL）：2×One Step Mix （Dye Plus） 25 μL，One Step Enzyme Mix 2.5 μL，上、下游引物各2 μL，核酸模板1 μL，RNase-free ddH2O 17.5 μL；反应程序：50℃ 30 min，94℃ 3 min，94℃ 30 s，51℃ 30 s，72℃ 45 s，35个循环，72℃ 7 min，4℃保存。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，及时拍照保存。
3 结果
肠道组织样品在兔血琼脂平板和普通营养琼脂平板表面均未出现疑似菌落，提示该猪群的发病排除常见的致病性大肠杆菌、巴氏杆菌及链球菌等细菌的混合感染。
样品猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪德尔塔冠状病毒病（PDCoV）、猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-CoV）RT-PCR检测为阴性，PoRV RT-PCR结果呈阳性，并得到与预期大小相符的目的条带，见图2。结果说明猪场本次疫情由猪轮状病毒单纯感染引起。
图2 PoRV RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳条带
注：M：DNA标准DL2000；+：阳性对照；-：阴性对照；1：粪便样品1号，弱阳性；2：粪便样品2号，弱阳性；3：粪便样品3号，阳性；4：粪便样品4号，阳性；5：病死猪肠道内容物，阳性
4 疫情的防控方案和措施
4.1 疫情隔离与场区封锁
1）立即隔离病猪：将已确诊或疑似感染猪只隔离到专门的病区，防止其与健康猪只接触；2）封锁感染区域：限制人员、车辆和物资进出猪场，避免病毒的进一步传播；3）设立消毒区，进出人员必须经过严格的消毒措施；4）避免猪群调动：停止猪群调运，尤其是感染区域内的猪只，防止病毒扩散。
4.2 紧急消毒与环境控制消毒工作
1）全面消毒：对猪场内所有区域进行全面的消毒，特别是猪舍、饲料存放处、猪场出入口等高风险区域使用次氯酸钠进行消毒；2）饲养环境卫生管理：及时清除腹泻粪污，减少病毒在环境中驻留时间；3）水源及饲料管理：确保饮用水源清洁，并添加适量的抗病毒药物，确保饲料不被污染，并使用抗应激饲料添加剂增强猪只抵抗力。
4.3 紧急免疫接种
对尚未感染的仔猪及妊娠母猪进行猪腹泻三联活苗的紧急接种，使其产生特异性保护和免疫力。母猪在分娩前注射疫苗使仔猪刚一出生就通过初乳获得被动免疫。
4.4 提示场内人员的防疫水平
对所有工作人员进行猪轮状病毒的防控知识培训，严格遵守生物安全操作规范，减少人员接触，避免交叉感染。
5
结论
本试验通过对粪便样品及腹泻仔猪肠道内容物进行RT-PCR检测，检测结果为PoRV阳性并排除了细菌的混合感染，该发病猪群诊断为PoRV感染。采取了针对性措施后，在3周至2个月后猪场疫情得到了有效控制。
最新发布
