低蓝耳病毒载量样本的成功测序

简介

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）是世界上传播最为广泛、复杂的猪病之一，该病毒易突变、重组，了解PRRSV的流行状况及变异特点，能够助力制定免疫方案、分析猪场疾病特点 。PRRSV的GP5蛋白是诱导产生中和抗体的主要结构蛋白，编码GP5蛋白的ORF5基因在一定程度上能反映PRRSV的遗传变异情况。现有测序方法主要使用的是一代测序技术（桑格测序），可对PRRSV病毒载量的Ct值在30以下的样本进行ORF5基因测序，但对Ct值超过30的往往测序失败。结合纳米孔测序具有长读长、实时测序的优势，本研究开发了基于PRRSV ORF5的纳米孔靶向测序方法，最短可在10min内得到目的序列全长，具有2.3×102个病毒拷贝的检测下限（对应Ct值为38），得到的目的序列与参考序列一致性为100%。相较于桑格测序，该方法的敏感性、特异性及时间周期得到大幅提升，可用于低病毒载量（高CT值）的PRRSV阳性样本进行准确测序。

方法

对Ct值为29.1的PRRSV细胞上清液分别进行10倍、100倍、1000倍和10000倍稀释后提取核酸，以三个平行样分别进行荧光定量PCR（RT-qPCR）和纳米孔测序（详细步骤见下图）。

测序流程及时间

结果

RT-qPCR结果显示4份样品的Ct值均值分别为32.1、35.0、38.2和40.0；30min的测序输出数据表明，前3份阳性样本的平均测序深度依次为1224X、11X、6.8X，覆盖度分别为100%、99.17%和99.17%，与参考序列的一致性均为100%，表明该方法具有很高的敏感性和特异性。

讨论

对于蓝耳病的防控来说，杜绝野毒株的循环至关重要，这就要求在低病毒载量样本中确保没有野毒株的存在。普通的测序过程中，PCR扩增后没有电泳条带或者条带很弱，桑格测序失败，无法对毒株及流行情况做出判断。这种情况下采用纳米孔靶向测序的方法可以很好的解决此类问题。纳米孔测序在便携性、成本和周转时间方面的优势意味着这种新兴技术可以在疾病诊断及流行病学监测方面发挥重要的作用。