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上世纪七十年代，准种的概念被提出并应用于病毒的遗传变异分析中，其是指受遗传变异、竞争、宿主选择及重组等一系列因素影响的高度同源但不完全相同的变异株组成的动态群体。作为一种RNA病毒，且在临床生产中药物、疫苗等多种筛选压力下，PRRSV极易变异与演化，大量的研究也已证实其在猪体内以准种（quasispecies）的形式存在。当出现具有更强适应性和增殖能力的PRRSV毒株时，便会取代正在流行的毒株成为优势毒株，而优势毒株是否致病则与猪只的免疫状态、饲养管理条件等多方面因素有关。
通过扩增PRRSV ORF5基因片段，采用Sanger基因测序进而了解PRRSV毒株流行情况的方式在临床生产中被广泛应用，该方法在PRRSV的分子流行病学调查研究、诊断鉴定（追溯系统的建立）及防控（后备猪的免疫驯化）等多个方面发挥了重要作用。那么，临床生产中，往往通过RT-PCR扩增产物直接测序来了解样品中PRRSV毒株情况，是否准确？
笔者将A、B两个PRRSV的PCR产物及其对应的15个亚克隆阳性菌落分别测序，结果显示，A与其15条亚克隆序列核苷酸同源性为87.7%-97.3%，A与其亚克隆序列被划分在了三个谱系（1、5、8），其中A与A-1、A-4等13条序列与经典毒株VR2332等划分在同一分支，属于谱系5；A-2与HP-PRRSV毒株处于一个大的分支，属于谱系8；A-11与NADC30-like毒株亲缘关系最近，属于谱系1；三个谱系1、5、8分别占比为6.25%%（1/16）、87.5%（14/16）、6.25%（1/16）；B与其15条亚克隆序列核苷酸同源性为87.9%-100.0%，B与其亚克隆序列被划分在了两个谱系（5、8），占比分别为68.75%（11/16）、31.25%（5/16），其中B与B-1等10条亚克隆序列属于谱系5。
（▲：PCR产物直接测序序列；●：亚克隆测序序列；）
结果分析及临床指导意义
(1) 样品B PCR产物直接测序与4条亚克隆序列一致（占比31.25%），与其它10条序列划分为同一谱系（占比68.75%），样品A PCR产物直接测序与亚克隆序列同源性最高仅为95.0%，但其与13条序列属于同一谱系（占比87.5%），PCR。
(2) 临床生产中，PCR产物直接测序结果往往会出现“双峰”甚至“乱峰”现象，峰图越乱，潜在表明ORF5丰富度越高、准种越为复杂，可能存在多种毒株感染情况，建议采用多个亚克隆测序方式了解PRRSV毒株情况。
(3) ORF5丰富度越高，猪群暴发PRRS的风险可能越大。同一猪只体内，ORF5丰富度越高（划分在不同谱系，或同一谱系但核苷酸同源性偏低），表明动物体内曾暴露或感染过不同PRRSV毒株（包括不同种类的减毒活疫苗毒株），更易发生变异与重组，PRRS暴发的可能性增大。尤其对于阳性稳定猪群，定期监测ORF5丰富度，对PRRSV暴发的提前预警具有重要意义。
(4) ORF5丰富度越高（划分在不同谱系），猪只健康度越低，尤其引进PRRSV阳性种猪时，应加强对ORF5丰富度的检测。
(5) 近年来，我国PRRSV流行毒株复杂化程度加剧，不同谱系甚至多谱系毒株之间的重组毒株越来越多，通过扩增单一片段无法真实反映动物体内数以万计序列的全貌，更不能完全代表致病性毒株。因此，为更好地了解临床致病毒株的基因组序列，建议采用多片段（GP5，GP3, GP2, nsp2, nsp9等）扩增测序分析的方式，当然有条件的猪场可以进行PRRSV全基因组测序。
作者介绍
张振东：中国农业大学预防兽医学博士，江苏科技大学硕士研究生导师，南京博维特健康管理有限公司技术咨询顾问。主要从事猪主要病毒性疾病的分子流行病学研究，专长于猪场常见疫病的实验室及临床综合诊断及分析。
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