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2025年2月，中国农业科学院生猪产业专家团、哈尔滨兽医研究所仇华吉研究员团队在知名学术期刊Emerging Microbes & Infections发表名为“Resveratrol inhibits African swine fever virus replication via the Nrf2-mediated reduced glutathione and antioxidative activities”的相关研究成果，揭示了白藜芦醇（RES）对非洲猪瘟病毒（ASFV）复制的抑制机制。
非洲猪瘟（ASF）是一种由非洲猪瘟病毒（ASFV）感染引起的烈性传染病，严重威胁全球养猪业的可持续发展，目前尚无安全有效的商品化疫苗。而抗氧化应激是抗病毒策略的重要因素。研究发现，ASFV感染会诱导活性氧（ROS）的产生并抑制核因子E2相关因子2（Nrf2）信号通路的激活，而过表达Nrf2显著抑制病毒复制。通过高通量筛选，作者发现作为Nrf2激活剂的白藜芦醇（RES）能够显著抑制ASFV的复制。机制探究发现，RES通过激活Nrf2通路，促进还原型谷胱甘肽（GSH）的产生并降低由ASFV感染诱导的ROS水平，进而发挥抗ASFV作用。总之，RES通过Nrf2信号通路表现出抑制ASFV复制和抗氧化应激的潜力，为防控ASF提供了新策略。
在本研究中，作者首先证实ASFV感染促进氧化应激反应，同时抑制了Nrf2信号通路。而Nrf2是一种转录因子，通过诱导内源性抗氧化酶的表达来维持细胞内的氧化还原平衡。过表达Nrf2可以抑制ASFV复制。通过对天然小分子的高通量筛选，作者发现作为Nrf2激活剂的RES对ASFV具有显著的抑制作用。通过非靶向代谢组学数据分析和进一步的试验验证，发现RES通过Nrf2介导的GSH的产生发挥其抗病毒和抗氧化作用。总之，本文研究结果为ASFV防控策略提供了一种新思路。
研究结果
ASFV感染诱导氧化应激
为探究ASFV感染是否诱导氧化应激，作者重新分析了实验室之前的转录组数据集。基因本体（GO）富集分析表明，与未感染组相比，感染组中显著富集与应激信号级联反应以及转录因子和抗氧化活性相关的分子（红色矩形）（图1A和B）。此外，为确定ASFV感染是否诱导ROS的产生，作者分别测定ASFV-WT感染猪原代肺泡巨噬细胞（PAMs）后12、24和48 h的ROS水平。结果显示，结果显示，与对照组相比，ASFV感染的PAMs中ROS水平显著升高（图1C），同时病毒基因组拷贝数和病毒滴度也显著增加（图1D和E）。表明ASFV感染诱导氧化应激的产生。
图1 ASFV感染诱导氧化应激
ASFV感染抑制Nrf2信号通路
考虑到Nrf2信号通路抵抗氧化应激的主要防御系统，基于对之前转录组数据集的重新分析，热图结果显示，ASFV-WT感染抑制了Nrf2信号通路中的关键基因的表达，包括GCLM、GCLC、Keap1和NFE2L2（Nrf2）（图2A）。为确定ASFV感染是否能够在体内外抑制Nrf2信号通路，作者将ASFV-WT感染PAMs并检测了Nrf2及其下游基因的转录水平。结果显示，ASFV-WT感染PAMs后12、24和48 h的Nrf2、γ-GCS、SLC7A11和GSR基因的mRNA水平均显著下调（图2B–D）。此外，研磨实验室之前感染ASFV-WT的猪组织并进行了RT-qPCR分析，结果显示，感染组中Nrf2、γ-GCS、SLC7A11和GSR基因的转录水平均显著降低（图2E–H）。总之，这些数据表明，ASFV感染抑制Nrf2信号通路的激活。
图2 ASFV感染抑制Nrf2信号通路
过表达Nrf2抑制ASFV在WSL细胞中的复制
鉴于ASFV感染抑制Nrf2信号通路，作者试图研究Nrf2是否能够抑制ASFV复制。由于与PAMs相比，WSL细胞具有更高的转染效率，因此，作者向WSL细胞转染了不同剂量的pMyc-Nrf2质粒。转染后24 h，感染1 MOI的ASFV-WT，并在感染后24 h进行Western blotting、qPCR和HAD检测。结果显示，过表达Nrf2显著降低了ASFV A137R蛋白的表达（图3A）、病毒基因组拷贝数（图3B）和病毒滴度（图3C），表明Nrf2在WSL细胞中显著抑制ASFV的复制。
图3 过表达Nrf2抑制ASFV复制
抗ASFV的Nrf2激活剂的筛选
为筛选能够激活Nrf2的抗ASFV小分子，作者建立了一种基于表型筛选的高通量筛选平台。首先，构建了荧光报告病毒rASFV-mRuby，并通过荧光观察和PCR鉴定确认其已被纯化。此外，结果显示，rASFV-mRuby的复制动力学与ASFV-WT相似，且全基因组测序分析表明其基因组中除插入的mRuby基因外无其他突变。随后，作者利用rASFV-mRuby建立了高通量筛选平台，以筛选抗ASFV的小分子。作者基于细胞成像系统平台筛选了128种小分子。其中，7种小分子对ASFV表现出显著的抑制作用，而RES是唯一的Nrf2激活剂。进一步鉴定RES对PAMs活力的影响，结果显示，当RES浓度≤ 40 μM时对细胞活力几乎无影响，其CC50为143.1 μM。
RES抑制ASFV复制
为确定RES确实可以激活Nrf2信号通路，作者用40 μM RES处理PAMs 48 h，测定Nrf2及其下游基因（γ-GCS、SLC7A11和GSR）的mRNA水平，结果表明，RES能够有效激活Nrf2信号通路（图4A）。随后，作者将rASFV-mRuby（MOI=1.5）与不同浓度RES共同加入至PAMs培养24 h，结果显示，RES显著抑制了ASFV的复制，其IC50为1.18 μM，选择性指数（SI）为121.27，表明RES具有显著的抗ASFV潜力（图4B–E）。此外，RES在作用PAMs 24、48和72 h均表现出持续的抑制作用（图4F），并对ASFV-WT（图4G和H）及不同基因缺失ASFV毒株，包括ASFV-ΔMGF、ASFV-ΔCD2v和ASFV-ΔMGF/CD2v均具有抗病毒活性。
为进一步评估RES是否通过Nrf2通路抑制ASFV复制，作者首先将三种特异性siRNA（siNrf2）转染至PAMs中，以确定哪种siRNA干扰效率最高。结果显示，siNrf2-2具有最显著的干扰效率（图S4A），并且在测试浓度下，这三种siRNA均对PAMs活力无影响（图S4B）。随后，作者将siNrf2-2转染至PAMs中。在转染后24 h，感染ASFV-WT或将RES和ASFV-WT的混合物共同加入至PAMs中。作用24 h后测定病毒基因组拷贝和滴度。结果显示，Nrf2的沉默降低了RES抑制ASFV复制的能力（图4I–K），表明Nrf2有助于RES发挥抗ASFV活性。
图4 RES抑制ASFV复制
在非靶向代谢组学分析中，谷胱甘肽是RES抑制ASFV复制的主要差异代谢物
为探究RES如何通过Nrf2抑制ASFV复制，作者设置三个组别：未感染组、感染组及ASFV-WT与RES共同处理组，进行非靶向代谢组学分析。正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）显示，各组代谢谱显著分离且组内样本聚类紧密（图5A），表明ASFV感染或ASFV与RES共同处理显著改变了细胞代谢状态。通过维恩图分析显示三个组中共有139种差异代谢物（图5B），而在其中前20位差异代谢物中，谷胱甘肽是唯一共有的差异代谢物。具体而言，ASFV感染显著上调了谷胱甘肽水平（图5C），而RES联合处理则下调了其水平（图5D）。这些结果表明，谷胱甘肽是RES抑制ASFV复制的主要差异代谢物，提示其可能通过调控谷胱甘肽代谢介导抗病毒效应。
图5 谷胱甘肽是RES抑制ASFV复制的主要差异代谢物
RES通过Nrf2介导的GSH产生抑制ASFV复制
为探究谷胱甘肽，特别是作为抗氧化剂的还原型谷胱甘肽（GSH）对ASFV复制的抑制作用，作者首先测定了GSH对PAMs的安全浓度。结果显示，在8 μM时，GSH对PAMs仍然没有细胞毒性。随后，作者将不同浓度的GSH（1、2、4和8 μM）与ASFV-WT（MOI=1）共同加入至PAMs中，作用24 h后测定病毒基因组拷贝和滴度。结果显示，GSH以剂量依赖性方式抑制ASFV复制（图6A和B）。
为进一步评估抑制GSH合成对ASFV复制的影响，作者首先测定GSH合成抑制剂BSO对PAMs活力的影响。结果显示，当BSO浓度≤ 5 μM时，未观察到细胞毒性。同时，作者检测了BSO处理的PAMs中GSH水平。正如预期，PAMs中GSH水平显著下调。之后，作者用5 μM的BSO预处理PAMs后，感染ASFV-WT，并在感染后24 h，测定病毒基因组拷贝数，结果显示，BSO促进了ASFV复制，进一步表明GSH可以抑制ASFV复制。
为探究RES是否通过GSH抑制ASFV复制，作者用BSO（5 μM）预处理PAMs 18 h以抑制GSH合成，之后接种ASFV-WT（MOI=1）或ASFV-WT（MOI =1）和RES的混合物，24 h后，分别测定病毒基因组拷贝数、病毒滴度和ASFV A137R蛋白的表达水平。结果显示，BSO处理降低了RES抑制ASFV复制的能力（图6C–E）。前面已经证明沉默表达Nrf2降低了RES对ASFV的抗病毒活性。为进一步探究RES是否通过Nrf2介导的GSH产生发挥其抗病毒活性，作者将siNrf2-2转染至PAMs中，并在转染后24 h测定细胞中GSH水平。结果显示，敲低Nrf2显著降低了PAMs内GSH水平（图6F）。这些结果表明，RES通过Nrf2介导的GSH产生发挥其抗病毒作用。
图6 RES通过Nrf2介导GSH产生抑制ASFV复制
RES通过Nrf2介导的GSH产生降低ASFV感染诱导的ROS水平
为探究RES是否可以通过GSH降低ASFV诱导ROS水平，作者将ASFV-WT或RES与ASFV-WT的混合物共同加入至PAMs中，以测定不同作用时间细胞内的ROS水平。结果显示，在12、24 和48 h时，RES均显著降低了ASFV感染诱导的细胞内ROS水平 （图7A）。同时，在此期间，RES显著增加了细胞内的GSH水平（图7B）。为进一步研究RES的抗氧化作用是否是通过激活Nrf2信号通路介导的，作者将ASFV-WT或RES与ASFV-WT的混合物共同加入至PAMs中分别作用12、24和48 h，收集进行RT-qPCR分析。结果显示，RES显著上调了Nrf2及其下游基因γ-GCS、SLC7A11和GSR的mRNA水平（图7C–E），表明RES通过激活Nrf2信号通路促进GSH的产生，从而发挥抗氧化作用。
图7 RES通过Nrf2介导GSH产生降低由ASFV感染诱导的ROS水平
综上，本研究首次揭示并阐明ASFV感染通过抑制Nrf2信号通路引发氧化应激，进而加剧疾病进展。RES作为Nrf2激活剂，通过激活Nrf2-GSH信号轴，同时发挥抗ASFV和抗氧化双重作用，这一特性凸显了Nrf2激活剂在抑制病毒致病机制中的独特潜力。研究结果为ASF的防控提供了新策略，尤其为缓解由病毒感染引起的氧化应激损伤提供了潜在解决方案，对防控病毒性疾病具有重要参考价值。
RES通过Nrf2信号通路发挥抗ASFV活性并降低ASFV感染诱导的氧化应激示意图
中国农业科学院哈尔滨兽医研究所刘迪博士和李连峰研究员为本论文共同第一作者，仇华吉研究员和孙元研究员为本研究的共同通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金项目（32372983和32202774）以及黑龙江省自然科学基金优秀青年项目（YQ2022C043）的资助。
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