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背景:猪场生产环节中的清洗、消毒和空栏生物安全措施对预防疾病爆发至关重要。至今无长时间空栏对保育舍细菌载量影响的研究。
方法:本研究评估保育舍空栏10天对总需氧菌、肠球菌、大肠杆菌、粪大肠杆菌类和MRSA的影响。10天内3个空栏时间段被监测。每个时间段使用3个单元。微生物载量分别在消毒前、消毒后空栏的第1天、第4天、第7天进行检测。
结果:大肠杆菌、粪大肠杆菌类、MRSA和肠球菌的减少或增加无明显差异。总需氧菌在消毒后第4天的数量最低（即4.07logCFU/625 c㎡）(P＜0.05)，但是和其他时间点的差异有限（即0.6logCFU/625 c㎡），可忽略。而且，第4天的检测未通过其他微生物参数证实。消毒后，饮水器仍然以总需氧菌（即5.32logCFU/625 c㎡）和肠球菌(即95%的样品为阳性)为主（P＜0.01）；食槽是最洁净位置（总需氧菌：3.53logCFU/625 c㎡、肠球菌：50%阳性）（P＜0.01）。
结论:本研究表明在不采取额外生物安全措施的条件下，延长保育舍空栏时间至消毒后10天对环境中总需氧菌、大肠杆菌、粪大肠杆菌类、MRSA和肠球菌的载量无影响。
01背景
断奶仔猪受到许多环境、行为和日粮应激影响。而且小肠菌群不均衡，使仔猪极易感染肠道疾病。动物圈舍爆发疾病可导致动物高死亡率和屠宰场的高废弃率。叠加预防措施（例如流行病监测）和动物销毁造成的经济损失非常严重。另外，人畜共患病是一个重要的、全球广泛传播的公共卫生疾病。
在保育舍，腹泻是造成猪业经济损失最重要的疾病之一。断奶后腹泻致病因素较多，但已证实致病性大肠杆菌在断奶仔猪整个小肠肠道增殖是主要原因。养猪业另外一种重要的致病菌是沙门氏菌。2011年，欧盟报告的绝大多数食源性疫情（69553例人感染病例）与动物制品相关。沙门氏菌是检出率最高的致病菌（爆发病例的26.6%）。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌398型（MRSA ST398）是家畜，尤其是猪中出现的机会致病菌。流行病学调查表明它不仅可以在猪群中定居，还可以通过直接接触传播给人。调查还表明MRSA ST6398造成人的感染还在不断增加。
通过生物安全措施预防疾病爆发比治疗动物更重要。生物安全包括所有可预防病原进入群体（外部生物安全）和减少病原在群体中传播（内部生物安全）的措施。在生产环节中，清洗、消毒和空栏常作为内部生物安全措施。每种生物安全措施可影响下批次动物进入后的感染压力程度。
Luyckx等表明肉鸡舍清洗步骤可减少2logCFU/625 c㎡的总需氧菌，消毒步骤可进一步减少1.5log CFU/625 c㎡。在保育猪舍，延长空栏时间的重要性还未知。本研究的目的是评估保育舍空栏10天期间总需氧菌、肠球菌、大肠杆菌、粪大肠杆菌类和MRSA的细菌载量变化。肠球菌和粪大肠杆菌类建议作为粪便接触表面卫生状况指示微生物。而且，大肠杆菌作为监视可能存在沙门氏菌的指示微生物。
02方法
2.1采样计划
本研究在农业和渔业研究所（ILVO，Merelbeke,比利时）试验场的6个独立保育单元（A1-A3和B1-B3）开展，每个单元由8个1.8 ㎡圈舍构成。仔猪断奶后（4周龄）立即转移至这些单元内并养殖6周。每个圈舍饲养6头仔猪。圈舍地面是纤维网格，下面有一块向中心水泥坑倾斜的木板。A1-A3单元在2015年2月和4月连续2次空栏期进行监测，B1-B3单元在2015年3月的空栏期进行监测。猪移出后，单元用水浸泡。次日，单元用热水（80℃）清洗，然后在同一天用1%(v/v) MS Megades（Schippers, Bladel, the Netherlands）消毒。消毒产品由戊二醛和季铵盐组成。清洗消毒后，圈舍保持空栏10天。在空栏期间，每小时用温湿度仪（Ilog EI-HS-D-32-L,ESCORT数据登录系统）对温度和相对湿度（RH）进行监测。每个单元随机选取3个圈舍在消毒前和消毒后第1天、第4天、第7天和第10天采样。每个采样时间点采集135份样品，共计675份样品。
2.2样品处理
海绵拭子样品（3M，SSL100，St.Paul，MN,USA）用10ml林格氏液预润湿（Oxoid,BR0052G,Basingstroke,Hampshire,英国），对每个圈舍的地面、水泥墙面、纤维墙面、饮水器和食槽5个区域采样。每个时间点每个单元采集15个拭子样品。为中和残留消毒剂的消毒作用，用10ml Dey Engley中和剂（Sigma Aldrich,Fluka,D3435,St-Louis,MO,美国）预润湿消毒后第1天采集的海绵拭子。采集表面积625 c㎡（A4纸大小）。由于饮水器表面小于625 c㎡，每个圈舍采集2个饮水器。样品立即冷藏运送至实验室处理。对于所有检测病原，所选择的相关参数和计数方法或检测技术均参考Luyckx等。拭子样品先用30ml的缓冲蛋白胨水（BPM，Oxoid, CM0509）稀释，然后放置于研磨器（IUL instruments,S.A.,Barcelona,西班牙）磨成匀浆。接种前，用拭子样品在连续稀释液蛋白胨水中进一步稀释，从而在选择的培养基上长出可计数的结果。平板计数培养基（Oxoid, CM0325）用于总需氧菌，倾斜培养基和麦芽糖培养基（Oxoid,CM0377）用于肠球菌（最低计数限制为30CFU/625 c㎡）。平板计数培养基37℃培养72小时，斜面培养基和麦芽糖培养基37℃培养48小时。将10ml的BPM匀浆转移至均质器并与10ml双倍浓缩的Mueller Hinton 肉汤（Oxoid,CM0405）、13%（w/v）氯化钠（Merck,1.06404.500,Darmstadt,德国）混合。通过37℃过夜孵育，取100ul接种于chromID MRSA SMART （MRSM,法国）上检测MRSA。chromID MRSA SMART于37℃孵育24-48小时。剩余的BPM匀浆（原样品）在37℃过夜孵育，用于大肠杆菌和粪大肠杆菌类检测分析。将10ul的营养肉汤接种于大肠杆菌快速培养基上（Biorad,356-4024,Marnes-la-Coquettes,法国），44℃孵育24小时。
2.3统计分析
用Q-Q图和直方图分析需氧菌和肠球菌的对数值分布。总需氧菌的对数值呈正态分布。采用线性回归模型评估空栏时间和位置对总需氧菌对数值（因变量）的影响。为评估预测变量（空栏时间和位置）对非正态分布结果变量的影响，描述不同细菌（肠球菌、大肠杆菌、粪大肠杆菌类和MRSA）计数和检测的变量转换成二元变量（缺失或低于检测限=0，存在=1）。然后进行logistic回归模型分析。在两种模型中，温度和湿度被添加为协变量。“单元”变量纳入两种模型作为随机影响来纠正一个单元测量的误差。
采用Tukey Kramer检验进行比较分析。P≤0.05被认为显著。所有统计分析用统计分析软件（SAS,9.4版本，SAS Institute Inc.,Cary,NC,USA）进行分析。
03结果
消毒前，总需氧菌的平均计数为5.64log CFU/625 c㎡（图1a）。大肠杆菌、粪大肠杆菌类、MRSA和肠球菌的阳性样品占比分别为49%、65%、16%（图2a）和95%（图3a）。
图1用标准误差对总需氧菌进行平均计数。对每个采样时间点（a）和消毒后区域（b）进行平均计数。在消毒前（0天）、消毒后第1天、第4天、第7天和第10天各采集135份样品。每个区域各采集108份样品。采样时间和区域之间的显著性差异由条形图上方字母表示。
图2 分别是大肠杆菌、粪大肠杆菌和MRSA的阳性比例。a图是采样时间点阳性占比，b图是消毒后位置阳性占比。在消毒前（0天）、消毒后第1天、第4天、第7天和第10天各采集135份样品。每个区域各采集108份样品。每种细菌采样时间和区域之间的显著性差异由条形图上方字母表示。
消毒后第1天，总需氧菌平均计数明显减少至4.44log CFU/625 c㎡(P＜0.01)（图1a）。第1天采集的135个样品中，大肠杆菌、粪大肠杆菌类和MRSA的阳性率分别为13%、23%和7%（图2a）。而且，69%的样品为肠球菌阳性（图3a）。大肠杆菌、粪大肠杆菌类和肠球菌的样本阳性率明显低于消毒前（P＜0.01）。
图3 肠球菌计数样本占比。a图是每个采样时间点阳性占比，b图是消毒后区域阳性占比。在消毒前（0天）、消毒后第1天、第4天、第7天和第10天各采集135份样品。每个区域各采集108份样品。采样时间点之间的显著性差异由条形图上的字母表示。
消毒后第4天，总需氧菌明显减少至4.07logCFU/ c㎡（P＜0.05）。只有7%的样品为大肠杆菌阳性，但是粪大肠杆菌类和MRSA的阳性样本数量更高（分别为25%和14%）。肠球菌增加至77%。
消毒后第7天，总需氧菌平均计数为4.24logCFU/625 c㎡。对于所有样品，大肠杆菌、粪大肠杆菌类和MRSA阳性率分别为15%、29%和13%，与第1天相比，70%样品为肠球菌阳性。
消毒后第10天，总需氧菌增至4.67log CFU/625 c㎡，比消毒后第4天高0.6logCFU（P＜0.01），但是与消毒后第1天的差异不显著。大肠杆菌、粪大肠杆菌类和MRSA的阳性占比分别为12%、24%和8%。此外，肠球菌的阳性率为79%。
综上，大肠杆菌、粪大肠杆菌类、MRSA和肠球菌在消毒后的不同采样时间点无明显差异。
在整个10天空栏期间，饮水器的总污染水平（总需氧菌）最高（即5.32logCFU/625 c㎡）（P＜0.01），食槽的最低（即3.53logCFU/625 c㎡）（P＜0.01）（图1b）。肠球菌结果证实该结论（P＜0.01），而且表明地面仍然高度污染（即84%的样品为阳性）（P＜0.01）（图3b）。大肠杆菌、粪大肠杆菌类和MRSA的结果未发现清洗和消毒后的重点污染区域（图2b）。
在空栏期间，平均温度在15~16℃，相对湿度（RH）为57~67%（图4）。这两个参数对不同细菌数值无明显差异。
图4 每个采样时间点的平均温度（℃）和相对湿度（RH，%）及其标准偏差。采样时间：消毒后第1天、第4天、第7天和第10天
04讨论
生物安全措施，例如动物圈舍清洗、消毒和延长空栏时间是养殖场预防疾病爆发的重要卫生管理内容。本研究中，消毒后10天空栏时间的影响用几种细菌指标进行检测。
消毒减少每个采样表面1.2logCFU的总需氧菌。在10天空栏期间，只有第4天的结果有小幅下降，尽管这看似微不足道（最大差异0.6logCFU/625 c㎡）。第4天观察到的总需氧菌的小幅波动和下降的可能原因是某些细菌处于存活但不能培养状态。这些不能培养的细菌未计数或用研究中的方法检测到。另外一种可能原因是由于与其他细菌缺乏生态位和营养竞争，残留菌在消毒后会再次繁殖。这些残留的细菌可能通过耐药机制或者消毒时残留的有机质等有害因素在消毒过程中存活下来。
另外，延长空栏时间甚至有负面影响，不仅低效的生产循环能造成经济损失（即低收入），包括细菌也是如此。例如，在生物安全有漏洞的情况下，害虫和啮齿等媒介可能会造成再次污染，尤其是同栋舍装满有动物或在清洗消毒后存在残留有机质（例如粪便和饲料）。苍蝇可能是沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、金黄色葡萄球菌和链球菌2型等多种细菌的宿主和媒介。野生啮齿动物也可以携带沙门氏菌、弯曲杆菌、耶尔森菌和MRSA ST398等病原。由于试点场生物安全措施执行较好，可猜想其他养殖场细菌载量和感染压力会在空栏期增加。
某些细菌可以在不同环境条件下生存很长时间，例如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌（包括MRSA）和肠球菌。本研究结果表明不采取其他生物安全措施，仅仅延长空栏时间不能减少这些细菌载量。额外的生物安全措施，如在空栏期的特定病原控制程序和害虫控制可能有利于减少细菌。
最后，对空栏期间几处区域的污染水平也进行分析。饮水器基本被总需氧菌和肠球菌污染。Luyckx等表明肉鸡舍饮水槽是清洗消毒的关键位置。来自这些污染源的饮水可能是引起动物发病的原因。因此，在清洗消毒和空栏期间应该特别关注这些区域。另外，建议对水线消毒，因水线可被生物膜和致病菌污染。由于本研究在试验场开展，其他养殖场在特殊结构设计或组成上与实验场不同，所以其他区域也该作为清洗消毒的重点。
05结论
本研究表明清洗消毒后不采取其他生物安全措施，空栏期延至10天对保育舍总需氧菌、大肠杆菌、粪大肠杆菌类、MRSA和肠球菌的细菌载量无明显影响。
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