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大家好，我是来自浙江农林大学的杨彩梅，今天非常高兴有机会能和大家一起分享益生菌产品的突破性应用。近二十年来我一直都在进行益生菌的研究和应用，在益生菌的研究和应用方面积累了非常多的经验。从2009年我和浙江惠嘉合作，拿到了农业部的丁酸梭菌和地衣芽孢杆菌的新产品证书，开创了我们国内丁酸梭菌和地衣芽孢杆菌的先河。在这20年的过程中，我觉得我在益生菌方面积累了很多经验，与此同时也走了很多弯路，所以今天想通过这个分享，避免大家走弯路，让更多人能够更好的用好益生菌产品，从而保证动物的健康让养殖更赚钱。
一、益生菌产品的应用
我们首先来看下益生菌产品的应用情况，其实从2016年到现在，我国的饲料添加剂行业增长的速度并不是非常的快，但是益生菌行业一直是以每年百分之十以上的数额在增长，可以说是复合型增长。特别是在2020年7月1日农业部全面禁止在饲料中添加抗生素之后，益生菌的增长量更是达到了22.7%，所以说大家都非常看好益生菌作为抗生素的替代物，也非常看好它的作用效果以及应用效果。根据目前兽药中常用的益生菌，其主要是以芽孢杆菌、丁酸梭菌、乳酸菌和酵母菌的单一或者是复合制剂为主。就芽孢杆菌而言，研究应用比较多的是枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，丁酸梭菌也算在芽孢杆菌里面。其实对于芽孢杆菌的应用，特别是丁酸、地衣和枯草的应用一直受到大家的广泛关注。对于枯草芽孢杆菌，大家可能还有一些小小的争议，因为枯草芽孢杆菌是一个严格的好氧菌，它很难在动物体内进行繁殖。就是说动物体内，特别是在益生菌要复苏的地方，直盲肠或者结肠是在阴凉的环境下，枯草芽孢杆菌会很难在这个里面存活或者复苏，但枯草芽孢杆菌依然有作用。为什么会有作用呢？其实很多人认为它在体外就已经产生了很多代谢产物并开始起作用。对于丁酸梭菌，目前普遍认为芽孢杆菌在整个益生菌领域方面是最优秀的一个菌种，因为它的特点就是抗逆性很强，又可以在液氧环境中生存，同时又能够产生很多有用的代谢产物，特别是还可以产生丁酸，作为肠道的营养补充剂，所以说起到一个非常大的作用！
目前丁酸梭菌在我们国内的应用也是非常的普遍，惠嘉在这方面起到了非常大的推动作用，我们也非常高兴有这样一个结果。还有应用比较多的益生菌，大家能想到的可能就是乳酸菌和双歧杆菌。乳酸菌和双歧杆菌都有产乳酸的一个作用，作用效果也很不错，这些已经得到大家的认可，因为它们的主要特点，是没有办法在高温环境中很好的存活。如果能解决抗逆性问题，乳酸菌在未来也是很好的一个益生菌，另外还有很多酵母菌也在广泛应用，但目前这些菌都是以复合制剂为主。不同的菌有不同的特点，通过复合制剂的话可以更好的突出各种益生菌的优点，克服它的缺点，起到更好的作用！
二、益生菌的作用
1、益生菌的核心作用
说到益生菌大家就要探讨它益生的作用，它的益生作用，目前基本上得到了研究应用的认可。普遍认为益生菌能够提高动物的生长性能，替代抗生素能增强免疫功能，能够修复肠道绒毛，能够增加消化道的消化酶活性，最重要的是调节肠道菌群，所以调节肠道菌群是目前大家认为益生菌发挥作用的核心所在。当然在调节肠道菌群的同时，大家也非常关注益生菌在维持肠道的屏障功能，改善肠道的免疫以及调节内分泌方面的各种作用。因为益生菌主要的作用是调节肠道菌群，那么肠道的菌群在哪里呢？胃里面肯定是没有什么菌存在的，因为胃里强酸性的环境是不利于菌的生长的，在十二指肠、空肠、近端回肠有非常少的菌存在，10的二次方就代表是几百个菌，对菌来说基本上是可以忽略不计，就是说有一个益生菌是在十二指肠或者是空肠起作用，那么我认为这个益生菌肯定不是一个真正意义上能够起大作用的益生菌，因为益生菌都不在这里，怎么调节十二指肠和空肠的菌群呢？益生菌都在哪里呢？菌都在盲肠或结肠，它有10的十一次方到十二次方。当然在远端回肠，也有大概上亿的菌存在，但主要是在盲肠或者结肠，所以说一个益生菌主要的作用是在盲肠、结肠或远端回肠。这些地方才能够起到真正调节肠道菌群的作用。但是盲肠和结肠包括远端回肠，基本上都是在肠道的后段，所以都处于一个阴凉的环境，所以说一个好氧的菌很难在肠道内真正发挥作用，原因就是没有办法在好氧的环境中很好的生存下来。其实菌群与动物或宿主之间是维持着一个平衡关系。因为一个健康人，可能定值达到的微生物数量是10的十四次方，重量的话有1.2到1.3公斤，种类的话大概有一千多种。而且数量是我们的体细胞的十倍以上，就是说动物体内有非常多的菌，但是正常情况下都处于一个平衡状态，因为肠道的微生物之间都有一个群体感应。肠道微生物也是一个小社会，在这个小社会里面它们互相之间会通过一些信号来维持相互之间的平衡，像我们人类的社会一样。群体感应对微生物的相互作用以及新的微生物之间会进行调整，形成一个具有稳定状态的微生物趋势，所以正常微生物趋势是稳定的。但如果某一种微生物的加入或是某一些致病菌的加入，破坏了这种平衡，那么就有可能混乱，会导致动物肠道菌群的失调。肠道菌群的主要作用就是是营养物质的重吸收功能。营养物质的消化吸收主要是在小肠，但是在小肠没有消化吸收的营养物质进入盲肠和结肠之后，就会在微生物的作用下，把这些没有消化的，比如碳水化合物、氨基酸类的物质，分解为乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸。分解之后可以使动物重新消化吸收，作为动物能量的一部分，所以菌群会影响着整个动物的能量代谢和营养物质的消化吸收。与此同时还会产生一些其他物质，产生的挥发性脂肪酸还可以作为细胞信号通路，来调节整个机体的代谢过程。肠道微生物在能量代谢或在机体的全身调节中都起了非常大的作用，同时肠道菌群还会调节免疫系统，因为肠道微生物可以通过很多的途径来影响免疫系统。肠道是最大的免疫器官，微生物在肠道中会对免疫功能有很大的影响：其可通过挥发性脂肪酸，就是短链脂肪酸像乙酸、丙酸、丁酸这类的酸类物质；也可通过影响T细胞从而影响我们细胞因子，比如白细胞介素-2α等；也可以通过这些细胞因子影响免疫系统，除了挥发因子像胆汁酸也可以通过一些脱样受体的细胞信号通路，从而起到一个影响免疫的作用；当然还有很多其它细菌的代谢产物也会影响免疫系统。微生物对免疫功能有非常强的影响作用，就是因为肠道微生物对能量代谢，对整个机体的微生物平衡以及免疫都有影响，所以说，益生菌就是针对一些肠道菌群的作用来进行调节。
2、调节肠道菌群平衡
益生菌第一个作用是能够调节肠道菌群的平衡，降低疾病和代谢的混乱。因为群体感应的存在，菌群处于一个平衡的状态，但是在应激状态下，比如细菌感染、病毒感染、过冷、过热的环境或者饲料的不合适都会引起菌群的失调，发生代谢混乱，群体感应也会发生变化，这样会引起营养物质的消化吸收发生变化，引起腹泻。大量的大肠杆菌存在还会诱发内毒素的血症，从而引起整个机体的代谢混乱。因为肠道的菌群处于异常状态的时候，益生菌就可以快速促进肠道菌群，让它回到一个平衡的状态，从而提高营养物质的消化吸收，减少肠道疾病的发生。益生菌还可以产生代谢产物，其代谢产物还有抑菌物质，拥有抑菌物质就可以来抑制这些病原菌的感染，从而使肠道菌群达到平衡状态。这是益生菌的第一个作用，调控肠道菌群的平衡，防止疾病和代谢混乱。在这个方面我们也做了很多的研究和应用，因为我是国内最早开始研究丁酸梭菌的学者之一，所以在丁酸梭菌研究方面发表了很多论文，也做了很多丁酸梭菌的发酵和应用方面的研究。研究发现丁酸梭菌可以调节感染结肠的菌群，增加菌群的多样性，增加有益菌的相对分度，增加结肠内的乙酸、丙酸、丁酸这些短链脂肪酸的浓度，从而促进机体的代谢过程促进动物的肠道健康。除了丁酸梭菌以外还有很多的研究表明，复合的芽孢杆菌比如枯草的复合菌，也能够调节肠道菌群，增强一些杯状细胞的分泌功能，改善由大肠杆菌引起的肠炎。
3、调节肠道免疫功能
益生菌第二个作用在于调控肠道的免疫功能，抵抗抗原的感染。因为我们前面讲到肠道微生物的作用是调控肠道的免疫功能，益生菌抗原通过一些代谢产物作用于淋巴细胞，促进T细胞、B细胞的活化，调控炎症因子的表达，促进抗体的表达和分泌，从而调控我们的免疫功能。另外像益生菌产生的这些挥发性脂肪酸，还可以保护肠上皮细胞免受病原菌诱导的细胞凋亡，从而保护上皮细胞的功能。
4、调控黏膜的浆细胞分泌免疫球蛋白
益生菌第三个作用，它还可以调控黏膜的浆细胞分泌免疫球蛋白，通过免疫球蛋白从而调节肠道的免疫功能。免疫是双向的，如果说肠道的免疫功能过强，大量的营养物质都用于免疫，没有办法用于生长，这样动物的生长速度也会较慢，饲料消耗比较多。如果免疫过弱的话，动物经常生病，它的生长状态也不会好，所以益生菌调控的免疫是让其处于正常状态，从而能够促进营养物质的消化吸收，促进动物的健康生长。益生菌的第三个作用在于它可以增强黏膜免疫功能，缓解肠道的一些损伤。比如干酪乳杆菌就能够预防大肠杆菌k88攻毒的断奶仔猪的肠道损伤，可以提高空肠上皮细胞紧密连接蛋白的表达。因为紧密连接蛋白对于肠道而言是非常重要的蛋白，如果紧密连接蛋白被破坏的话，各种病毒、细菌很容易入侵到细胞里面去。也可以促进杯状细胞的分泌功能，杯状细胞分泌黏液可以起到保护肠道屏障功能的作用。
5、调控机体代谢
目前还有很多的研究表明益生菌还作用于调控机体的全身代谢，现在普遍认为肠道菌群和大脑之间存在双向调控的一个途径，包括肝胆代谢，神经元的支配，肠道内分泌以及微生物的信号通路等。现在人类医学上已经把益生菌和人类疾病，包括抑郁症都联系起来了，但是在这个过程中，菌群的代谢产物是起主导作用的，不是菌本身起作用而是菌的代谢产物起作用。人类医学上关于益生菌的研究越来越多，开始注重怎么进行粪便的移植，来更好的保证人类的肠道健康，对动物来说益生菌要怎样选择，怎样应用，怎样的益生菌是能够起作用的，怎样的益生菌效果并不是很好。研究很多方面，但是在作用上面到底怎样用会更好，还有很多的困惑。我们进行了20多年的益生菌的研究，拿到了丁酸梭菌和地衣芽孢杆菌的新产品证书，在国内也是第一个。有十多项益生菌的研究成果，四十多项的益生菌研究专利，还获得了国家科技进步二等奖。在研究和应用的过程中发现，有些益生菌作用效果很好，有些的效果却不尽人意。那到底什么样才算好呢？我们经过这么多年的研究，在2000多株的储备菌株中，通过研究发现，什么样的菌株可能是好的，就是益生菌是怎样来起作用的，到底通过什么来起作用，只有明白这个问题才能知道什么样的益生菌是好的益生菌，什么样的益生菌能够真正起作用，在什么样的情况下能起作用。
三、益生菌的作用机制
在20多年来我们在益生菌的研究方面也经过了多次迭代。在2009年我们拿到新产品证书的时候，我们认为益生菌就是提高它的发酵水平。选择了好的益生菌之后就开始研究怎么提高它的发酵水平，从十亿到一百亿到一千亿，只有发酵水平的提高才能降低益生菌的应用成本。但是后来慢慢发现有些产品十亿比一百亿的更好，这是为什么呢？其实这个问题也很好理解，这个是因为菌株的不同，就和人一样，选十个特种兵和选一百个乌合之众，进行对抗的时候肯定是十个特种兵更有优势，所以选择一个能力特别强的菌株具有很好的作用。这么多的地衣芽孢杆菌到底哪一个是最好的呢？所以菌株的选择很重要。生长速度快、抗逆性强、代谢产物多、发酵更容易、更适合肠道环境的益生菌的菌株最重要。经过多年的菌株选择之后，我们又开始思考在菌株选择上到底用什么来评价它。是以生长速度快来评价它，还是适应肠道来评价它，还是用代谢产物来评价它。最后我们发现代谢产物才是益生菌真正发挥作用的核心，所以选择一个益生菌，要选择具有强抑菌性的代谢产物这样的标准来进行益生菌的选择才是最重要的。从其他例子中我们也能得知，比如这么多的大肠杆菌，有些产毒有些不产毒，为什么呢？因为一些产毒素的大肠杆菌就认为它是有害的，不产毒素的就认为它是无害的。所以对益生菌来说也是一样的，具有很强抑菌性代谢产物的益生菌作用会更明显，其他的菌效果可能就不太明显，所以益生菌的关键作用来自于代谢产物。
对于益生菌的研究，普遍认为益生菌的作用机制是两个方面：第一个是“占位”，就是益生菌会粘附在肠道上，抑制有害菌在肠道上定值，其实这个定值是很少的，大部分的益生菌很少会在肠道上定值，定值也不是很大；第二个是“竞争”，益生菌和有害菌竞争营养物质，益生菌就可以很好的生存，抑制有害菌。有时候有害菌的生长速度更快，比益生菌还快，这时候就很难竞争，所以益生菌一定要靠它的代谢产物来起作用，那么多的代谢产物最重要的是什么呢？就是它产生的一些抑菌蛋白，比如一些抑制有害菌的物质，一些会产生有机酸，还有一些产生机体免疫，产生维生素、氨基酸或者刺激免疫球蛋白等，从而促进营养物质的吸收。但是代谢产物具有强抑菌性的益生菌才能够适应我们这个无抗的时代。我们在做很多实验的过程中都发现，把益生菌和它的发酵液分离开分别进行实验就会发现，发酵液有很好的抑菌作用，但益生菌本身却没有什么抑菌作用，所以这也进一步说明了益生菌的代谢产物是起主要作用的成分。那我们在选择益生菌的时候是不是说既然益生菌的代谢产物能起作用，是不是要让它适应肠道，在肠道中产生的代谢产物从而来起作用呢？当然是需要的，但不是最重要的。因为益生菌在肠道中，肠道并没有提供一个非常适合的环境让益生菌很好的发酵来产代谢产物，所以益生菌的体内发酵是有作用的，但是如果要真正发挥益生菌的作用，一定要体外发酵产代谢产物，因为在体外发酵的过程中，我们可以更好的调控它产生更多的代谢产物和抑菌物质，这样才能更好的发挥作用。我们对益生菌的思考是认为益生菌和代谢产物都能有作用，但是最重要的是代谢产物。只有代谢产物具有强抑菌性才能适应无抗时代的需求。
那益生菌产品里面是否含有代谢产物呢？大部分益生菌产品里面是不含有具有抑菌性的代谢产物。为什么呢？因为益生菌在发酵过程中大部分采用的是液体发酵，液体发酵的过程中会进行离心，离心的过程中会把百分之九十的水分去掉。大部分抑菌物质都在水分里面，剩下百分之十我们还要干燥，干燥过程中还有可能百分之三十的损失，所以说百分之百的抑菌产物，到产品里面可能只有百分之七，这样能发生抑菌的效果就非常有限。要实现益生菌的抑菌，或者实现更好的作用，我们认为需要定向选择超强的具有抑菌性的菌株，然后还要进行定向的发酵培养，最大化产生抑菌的代谢产物，然后通过一些保护性的工艺从而最大化的留存这些代谢产物。就是说我们要选一个好的菌，还要尽量的给它们好的条件产这些抑菌的代谢产物，之后在干燥的过程中要把这些代谢产物很好的保留下来，这样才能使益生菌发挥真正的作用！
四、嘉培3号的突破性表达
我们从2017年开始就在筛选，筛选怎么样找到具有强抑菌性的代谢产物的益生菌，我们在2017年的时候HJ0135的地衣芽孢杆菌，它非常的高效，发现它的时候也非常的兴奋。它的抑菌性能是普通菌株的20倍，不论是大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄杆菌、产气荚膜梭菌的抑菌圈都非常的大。选择这么好的菌株后要进行多次的诱导、选育，最后得到HJ0135这个菌株，它的代谢产物具体非常强的抑菌作用。但是只有这个菌还不行，还需要通过不同的发酵方式来使它的代谢产物的抑菌能力最大化。因为有时候在实验室它的抑菌效果很好，但是去大生产的时候效果并不好。主要原因是我们的产物发酵方式，没有使我们益生菌代谢产物抑菌能力最大化。经过实验，我们发现不同的发酵方式抑菌圈的直径是完全不一样的，有些甚至没有抑菌作用，有些作用却非常的明显。以产气荚膜梭菌为例，有些发酵方式它的抑菌圈只有20个毫米，但是有些发酵方式可以达到33个毫米，达到33个毫米说明它的抑菌能力非常的强，可以和某些抗生素来媲美了。
我们的菌和市面上的菌也进行了一些对比，从金黄色葡萄杆菌、产气荚膜梭菌而言，我们筛选的嘉培3号的抑菌性能都远远的高于其他的产品，与沙门氏菌、产气荚膜梭菌来比，嘉培3号也有一定的优势。但是对于饲料添加我们不可能添加菌的原粉进去，可能最多添加500ppm或者1000ppm，所以我们进行稀释，稀释了10倍、100倍、1000倍、2000倍，发现对大肠杆菌和沙门氏菌有一定的抑菌作用，对金黄色葡萄球菌和产气荚膜梭菌具有非常强的抑菌效果。我们也和市面其他号称不错的一些产品进行对比，发现当稀释了1000倍时，基本上市面的产品就没有抑菌作用，而我们的产品稀释了1000倍之后，对金黄色葡萄球菌和产气荚膜梭菌还是拥有不错的抑菌效果，稀释了2000倍也有抑菌作用，这说明我们的产品经过稀释之后还是具有很强的抑菌作用。我们也进行了最小抑菌浓度的实验，结果发现对产气荚膜梭菌，嘉培3号最小抑菌的浓度，在饲料中添加200ppm就有很好的抑菌作用，对于金黄色葡萄球菌的话，它的最小抑菌值在500ppm，这是其他产品很难达到的。
选择了具有这么好的抑菌效果的益生菌之后，我们马上对益生菌的成分进行分析，我们发现它的抑菌物质主要集中在一百到四百个蛋白，其中起主要作用的是两个：一个是核糖体修饰蛋白，由32个氨基酸构成，它在很低浓度下就可以有很好的抑菌作用；第二个是地衣素，成分是由七个氨基酸组成。我们也进行了抗生素的分析，结果发现它完全不是杆菌肽，不是抗生素。然后我们对它是不是其他抗生素进行第三方的检测，把所有需要检测的抗生素都检测了一遍，结果发现都不是任何一种抗生素，它就是一个来自益生菌经过非基因改造，但优于益生菌的这样一个代谢产物，是一个绿色安全的产品。除此之外，我们还进行了抗逆性的分析，看它在胃液中的稳定性怎么样，结果发现它在胃液中是非常稳定，不会受胃液的影响。对产气荚膜梭菌有36个毫米的抑菌圈，对金黄色葡萄球菌也是35个毫米的抑菌圈，这就说明它有非常强的抑菌作用，不受胃酸影响。我们也进行了热稳定性的分析，就是在八十度的水浴十分钟和在八十度水浴三十分钟进行了比较，结果发现无论是水浴十分钟还是水浴三十分钟，它的抑菌性能都是丝毫不受到影响的，这就说明嘉培3号在饲料中是非常好的，适合添加的，不会受到饲料影响。除此之外我们还进行了酶活的检测，因为丁芽孢杆菌，我们选择的菌株除了产抑菌物质外，还有产酶的能力，它还产纤维素酶、酪蛋白酶、淀粉酶的能力，可以促进营养物质的消化吸收。
在进行体外抑菌性和特性的实验之后，我们还进行了很多的动物实验。我们在江苏的一个猪场选择母猪进行了实验。因为产气荚膜梭菌很容易引起母猪的胀气病，所以我们首先用母猪进行实验，结果发现添加300克到500克的嘉培3号之后，显著降低了母猪胀气病的发病率，也可以显著的降低断奶仔猪的腹泻率，有利于母猪的生存性能和仔猪的生产性能提高。我们也在浙江的猪场进行过产气荚膜梭菌的实验，使用嘉培3号两个星期之后，胀气病就下降了百分之四十多。我们也在育肥猪上进行了胀气病的实验，育肥猪的胀气病实验效果就会更好，当使用嘉培3号一周，胀气病就显著下降到基本上消失。在进行实验的同时也进行了另外一个厂家的抗产气荚膜梭菌的益生菌的实验，但是他们没有明显效果，但嘉培3号可以显著的降低产气荚膜梭菌的量，减少胀气病的发生率，提高生长肥育猪的生长性能，降低腹泻率。对于断奶仔猪我们也进行了实验，从断奶仔猪的应用上面我们可以看到，可以显著的提高平均日增重，因为它除了抑制产气荚膜梭菌的作用外，对黄金葡萄球菌、大肠杆菌也有比较好的抑制作用，可以显著提高日增重，降低腹泻率，特别是提高到500g的时候腹泻率显著的降低。我们也进行了一些结肠内容物的测定和回肠的绒毛高度的测定发现，嘉培3号可以显著的减少断奶仔猪的回肠的绒毛高度，降低回肠绒毛的凋亡率，增加结肠内容物的丙酸、丁酸、异戍酸含量，提高了营养物质的消化吸收。也进行过肠道菌群的测序发现，嘉培三号能够提高肠道有益菌的丰度，还能够改变结肠内的优势菌菌群和它的代谢功能，使代谢功能向着营养物质的吸收利用的方向来前进。另外，我们还做了攻毒的实验，我们采用断奶仔猪进行连续的攻毒，攻毒之后进行屠宰，结果发现用了嘉培3号之后产气荚膜梭菌的数量减少了一百倍，大肠杆菌的数量也减少了十倍，显著抑制了产气荚膜梭菌和大肠杆菌，也增加了结肠内的短链脂肪酸的含量。我们在家禽上也进行了很多的实验，对家禽而言，坏死性肠炎是由产气荚膜梭菌引起的难以防治的疾病，所以我们进行了产气荚膜梭菌攻毒的实验，攻毒之后发现肝脏的坏死和肠道的病变，但是用了嘉培3号后可以明显可以看到肠道没有发生病变，肝脏也没有出现坏死。增加到三百克以后，产气荚膜梭菌的数量可以降低一百倍以上，就是降低两个数量级。我们也进行了大规模的肉鸡的应用发现，可以显著的降低肠炎的发生率，提高日增重，肠道会更健康，没有什么出血点，比对照组情况好很多。此外我们在肉鸡的肠道菌群结构菌群发现，嘉培3号能够减少盲肠中有害菌的相对丰度，调节菌群的结构，增加盲肠菌群的多样性，从而有利于营养物质的消化吸收利用。
总结起来我觉得我们在益生菌方面的突破，就是我们筛选到了具有超强的抑菌能力的益生菌，同时我们通过发酵、流程的改进真正在动物体内发挥最大作用，而且是绿色安全没有抗生素，具有很强的抗逆性，耐受饲料的高温处理，非常适合在饲料中添加。我认为益生菌未来要突破的话，还需要选择具有更好抑菌效果且安全的益生菌菌株，并对代谢产物进行精准研究，通过荧光蛋白标记研究益生菌在体内的代谢过程，破解益生菌肠道代谢黑箱，从而使益生菌能够更好的在替抗产品中发挥更好的作用，促进我们养猪业的健康发展。
我今天的分享到这里就结束了，希望大家能够到浙江农林大学来指导，到浙江惠嘉来指导，谢谢大家！
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