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对于奋战在防非一线的人来说,Ct值不是个陌生的名词,你了解Ct值真正的含义吗?

猪相关2021-04-20 09:47:39

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对于奋战在防非一线的人来说,Ct值不是个陌生的名词,但据笔者的了解,似乎并不是所有人完全理解Ct值的含义。本文尝试简单梳理一下关于Ct值的一些背景知识。

对于奋战在防非一线的人来说,Ct值不是个陌生的名词,但据笔者的了解,似乎并不是所有人完全理解Ct值的含义。本文尝试简单梳理一下关于Ct值的一些背景知识。

 

什么是PCR?

 

想要知道Ct值,先要了解PCR。PCR,聚合酶链式反应,DNA聚合酶介导的合成DNA链的反应。是对目标DNA片段进行扩增(大量的翻倍复制)的方法。

 

为什么需要对DNA片断进行扩增?因为通常情况下病毒DNA的含量太低了,即使是经过了提纯,仍然没办法直接测量有无和多少,所以需要通过PCR技术扩增。以目标DNA为模板,对这段DNA进行复制粘贴,使这段DNA能够检测到,甚至达到可以用肉眼看的到的量。

 

扩增一次需要一个特定流程,即通过高温使一个双链DNA拆成两个单链,然后降温到聚合酶的活性温度,聚合酶以两个单链DNA作为模板,又生成两个新的双链DNA,即实现了对原来DNA片段的“克隆”。所以我们使用的PCR仪,本质是一个温控设备,而其中用到的聚合酶当然也必须是可以耐高温的聚合酶。

 

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如何确定要复制哪一段DNA呢?这时候就需要使用引物(与目标DNA序列互补的一个短片段)来开个头,从而引导后续的合成,这样就确保只对目标DNA序列进行扩增。

 

通过一次这样的程序,1个目标DNA片段变成了2个。而之后的流程则是重复这个程序,所以一个这样的程序称为一个循环(Circle)。原理上,如果只有1个目标DNA片段,经过1次循环获得2个同样的DNA片段,如果经过5次循环得到2^5个同样的DNA片段即32个,如果40个循环得到2^40次方个这个DNA片段,即1,099,511,627,776个。当然如果送检样本里没有目标DNA,0^40次方仍然是个0。

 

注意这里有个前提,就是必须有足够量的合成原料,即引物和游离核苷酸。所以PCR反应中产生的DNA片段与细菌增值曲线类似,前期指数增长,后期如果原料耗尽则曲线拉平。

 

Ct值的含义

 

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在PCR技术的基础之上,通过一定的技术设计,可以实现对合成的DNA的数量进行实时定量检测,也就是实时定量PCR技术,qPCR。

 

而测量的方法则一般是通过检测荧光信号的强度来实现,比如我们可以在反应体系中加入某种荧光染料(方法之一),这种染料特异性的掺入DNA链之后就会发出荧光。结果制造出的目标DNA片段数量越多,则发出的荧光越强。

 

给荧光强度设定一个检测阈值,即所需测量的荧光的强度超出背景荧光强度的临界点(也就是Ct中的t,threshold),当需要测量的荧光强度超过这个阈值时,这个时候跑了多少个循环(Ct中的C,即代表Circle),如果跑了25个循环,那么Ct值就是25。

 

当原始样本中目标DNA的越多,达到这个临界值所需要的循环次数越小,所以Ct值越小意味着,原始样本中这种DNA的浓度就越高,对于非瘟检测来说,就是非瘟感染越严重。

 

通常实时定量PCR跑40个扩增循环,如果Ct值小于29被认为是强阳性,如果Ct值在30-37之间认为是阳性,Ct值在38-40之间,则可能是含有最小量的目标DNA,也可能是环境污染导致。


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标签 : Ct值 真正 含义
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