摘 要
猪肋骨数具有重要的经济价值，研究表明肋骨数的个体差异受VRTN基因影响，为明确VRTN基因在天康猪群中的遗传效应，为培育多肋商品猪提供基础数据。采集283头不同品系种公猪耳组织样品和230头三元杂交商品猪肌肉样品，检测VRTN基因ins291位点基因型，进行商品猪VRTN基因型与肋骨数的关联分析，分析不同品系种公猪的VRTN基因型频率。发现所检测群体中VRTN基因ins291位点存在多态性，有QQ、Qq和qq三种基因型；该位点处的插入突变对商品猪的肋骨数表型变异影响极显著（P＜0.01）。
长白公猪群中有利等位基因Q基因频率为A系＞B系；大白种公猪群中有利等位基因Q基因频率为A系＞B系；有利等位基因Q频率为：杜洛克公猪群中BC系＞C系＞AC系＞B系。VRTN基因对肋骨数的遗传效应得到验证，以QQ为优势基因的A系长白、A系大白、BC系杜洛克和C系杜洛克种猪可用于生产多肋商品猪。
关键词
猪；VRTN基因；肋骨数；多态性；关联分析
人们于20世纪中期，观察到家畜的脊椎数目有发生变异的现象。至今发现具有多脊椎性状的家畜包括猪、羊和牛。野猪及中国大部分地方猪种的脊椎总数为一般为19～20根；西方商业猪种对于脊椎数相关的体长、胴体长等性状进行了高强度的人工选择，使得西方商业猪种脊椎总数达到21～23根，其中胸椎数为14～16根，腰椎为5～7根。
遗传因素是影响猪脊椎数目的主导原因，并且多脊椎性状是遗传力（0.6～0.74）很高的重要经济性状，因为它与猪的体型、胴体长度和产肉量有关。脊椎数偏多的个体相对一般个体体型长、产肉性能高；据估计，多一根脊椎骨可以使胴体长度增加约为40mm，体重增加约4～8kg。
脊椎动物的脊椎骨形成于胚胎发育早期，其形成过程复杂，受多个基因的调控，具体调控机制还未明确，因此诸多候选基因需要不断地去探索和发现。目前，遗传研究表明调控猪肋骨数变异的关键因素是VRTN基因的遗传多态性，研究商品猪的VRTN基因与肋骨数性状的关联性及不同品种猪的VRTN基因遗传效应，可为猪产肉性能的提高提供重要的分子依据和理论基础，具有重要的实践意义。通过选育胸腰椎数较多的专门化培育品系，在生猪养殖上具有重大的经济价值和意义。
Nakano等研究表明，VRTN基因可作为一种有效的选择标记，用于获得具有高胸椎数和长度相关性状的猪，而不会对肉类生产性状产生不利影响。闫德超通过对718头法系和324头美系大白猪VRTN基因ins291位点进行研究，确定VRTN基因是影响猪脊椎数变异的基因，同时也是使猪只体长和乳头数增加以及提高生长速率的有利等位基因。
我国养猪界习惯把从某国引入的种猪称为某系种猪，例如美系、加系、丹系、法系等。本研究以天康畜牧有限公司商品猪和8个不同品系的种公猪为研究对象，通过检测VRTN基因多态性，验证VRTN基因在天康猪群中的遗传效应，比较不同来源种猪的多脊椎基因频率，以期为天康种猪的选育提供理论依据，加快多肋基因的品系及品种选育，提高猪的产肉性能以及养殖效益。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 样品的采集及表型测定
本实验所需的283头种公猪和230头商品猪来自新疆天康畜牧公司，种公猪和商品猪分别采用相同的生产流程和营养标准。
商品猪样品采集及表型测定：试验所需的商品猪样品均来自新疆天康食品公司屠宰场，对230份商品猪胴体数清肋骨数，采集肌肉样品提取DNA。
种公猪样品采集：选择体况良好的283头存栏种公猪采集耳组织样品提取DNA，记录个体和品种信息。
1.1.2 主要实验仪器和试剂
主要实验仪器和试剂见表1。
1.2 实验方法
1.2.1 基因组DNA的提取
取猪组织样品各0.1g在1.5mL EP离心管中，在保证无相互污染的情况下，用手术剪将样品充分剪碎。按照TIANGEN公司组织基因组DNA提取试剂盒说明书，提取实验猪耳组织和肌肉组织样品基因组DNA。基因组DNA提取后，利用NanoDrop2000超微量分光光度计检测DNA的纯度和浓度，稀释至100ng/µL左右用于PC扩增，-20℃冰箱保存备用。
1.2.2 PCR扩增
依据文献中研究的影响猪肋骨数性状的VRTN基因g.20311_20312 ins291位点，设计引物。用2%琼脂糖凝胶对扩增产物电泳分离，依据条带大小对商品猪和种公猪不同个体VRTN基因ins291位点进行分型判定。
引物由新疆昆泰锐生物技术有限公司合成。引物序列见表2，PCR反应体系：2×Taq MasterMix（7.5µL）、ddH2O（6.2µL）、PCR上、下游引物（10µM，0.4µL）及DNA模板（100ng/µL，0.5µL）混合总体积为15µL。PCR反应程序：预变性（95℃，5min）、变性（95℃，30s）、退火（60℃，30s）、延伸（72℃，30s）、终延伸（72℃，5min）、保存（-4℃，60min）。
1.2.3 基因多态性检测
对PCR扩增后产物用2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，置于凝胶电泳成像分析系统中拍照。基因型检测VRTN基因影响胸椎数是通过一段291bp的序列插入造成，琼脂糖电泳检测PCR产物呈现出多态性。
1.3 数据的统计与分析
用EXCEL对基因频率和基因型频率进行原始数据整理，同时计算群体遗传多态性参数,包括多态信息含量（PIC）、有效等位基因数（Ne）、遗传杂合度（He）。并使用Hardy—Weinberg平衡性检验。
运用IBM SPSS Statistics19软件的一般线性模型（General Linear Model）对基因型效应进行分析，将不同基因型作为标记效应，从而建立固定模型对不同基因型之间的肋骨对数（平均值±标准差）进行F检验和多重比较。基因型效应与肋骨对数相关分析模型：
Yij＝u＋Markeri＋eij
其中：Yij为群体中个体的肋骨数表型记录值，u为群体的肋骨数表型平均值，Markeri为候选基因的基因型的标记效应，eij为随机误差。
2 结果与分析
2.1 VRTN基因PCR产物扩增结果及基因判型
用2%的琼脂糖凝胶电泳对VRTN基因PCR扩增产物进行检测，结果如图1所示。
当插入突变为411bp目的片段的基因型为QQ型，仅含有120bp的目的片段的基因型为qq型，分型为两条带既有411bp又含有120bp片段的基因型为Qq型。经检测后可知，在商品猪和种公猪群体中VRTN基因目的片段的3种基因型均存在。
2.2 VRTN基因多态性对商品猪肋骨对数的影响
在天康杜长大三元杂交商品猪群体中，个体肋骨对数呈现QQ型＞Qq型＞qq型的趋势，且VRTN基因ins291位点处为QQ型个体的平均肋骨对数比qq型个体平均肋骨对数多1.23对，如表3所示，QQ型个体的肋骨对数极显著高于Qq型个体的肋骨对数（P＜0.01），极显著高于qq型个体的肋骨对数（P＜0.01）；Qq个体的肋骨对数极显著高于qq型的肋骨对数（P＜0.01）。
由商品猪肋骨对数与基因型数量关系可知（如表4），14对肋骨数的商品猪共有92头，qq基因型数量最多，占59.8%；15对肋骨数的商品猪共有103头，基因型数量最多的是Qq型，占61.2%；而在16对肋骨数的35头商品猪中，不存在qq基因型，QQ型数量最多，占77.1%，说明肋骨对数与VRTN基因ins291位点处的插入突变相关。可以推断VRTN基因ins291位点因为存在插入突变（QQ基因型），所以会使肋骨对数有增加的趋势，则Q为肋骨对数变异的有利等位基因。经χ²检验，商品猪群体的χ²＜χ² 0.05（2）=5.99，表明该群体处于Hardy—Weinberg平衡状态。
2.3 不同品种种猪VRTN基因型分布
长白种猪中，A系长白QQ为优势基因型（如表5所示），而B系长白的优势基因型Qq（0.49）。等位基因Q基因频率为A系长白＞B系长白。因为Q为有利突变基因，且长白猪一般作为二元母猪的父系，故可选择A系长白作为种猪对后代进行育种改良，可以增加后代群体中的多肋基因频率。
大白种猪中，A系大白、B系大白的优势基因型分别为qq（0.60）和Qq（0.58）（如表5所示），等位基因Q基因频率为A系大白＞B系大白。两个品系大白猪有利基因Q频率都大于0.5，在后期选择可以选A系大白作为二元母猪母本。
杜洛克种猪有4个不同品系，除B系杜洛克以Qq（0.58）为优势基因型（如表5所示），AC系杜洛克、BC系杜洛克及C系杜洛克都是以QQ为优势基因型。有利等位基因Q频率为：BC系杜洛克＞C系杜洛克＞AC系杜洛克＞B系杜洛克。可见BC系杜洛克作为终端父本种畜具有较大的优势。
3 讨 论
VRTN是一种蛋白编码基因，具有特异性DNA序列结合位点及转座酶活性。在人的不同组织或细胞中，VRTN基因的表达量不同，但差异不显著；在小鼠的巨红细胞祖细胞、胚胎干细胞系V26-2-P16和胰腺中高量表达，但在其他组织或细胞中基因的表达丰度几乎无差别，均较低。对斑马鱼的研究表明，VRTN基因是一个核内定位的转录抑制因子，是一种新的在斑马鱼卵细胞植物极定位的母源因子，VRTN与bmp2b调控序列结合，并作为阻遏物抑制其合子转录。在受精后迅速地向动物极移动，独立调节bmp2b基因在背腹轴的表达，确保bmp2基因在背腹轴正常的浓度梯度，从而使胚胎背腹轴发育正常。
范寅等对来自白色杜洛克与二花脸杂交F2代、苏太猪、二花脸与通城猪杂交这三个群体进行全基因组关联分析，发现VRTN基因的g.20311_20312ins291位点与肋骨对数表型关联极显著。张慧通过对609头杜长大三元杂交猪进行试验，确定g.19034A＞C及g.20311_20312ins291是功能性突变位点，符合因果突变的特性，并且这两个位点对VRTN的表达具有加性遗传效应。
吴一尘等对苏淮猪VRTN基因ins291位点进行多态性分析，研究表明苏淮猪群体存在高脊椎数等位基因。陈伟等对大白猪群体进行研究，从而推断VRTN基因中SINE插入多态也许与猪瘦肉率和生长速度有关联，可能会使猪生长速度和眼肌面积降低，并不影响产仔数。可见VRTN基因ins291位点突变会使猪肋骨对数产生增加效应，具有加性遗传效应。
李娜等研究松辽黑猪VRTN基因多态性与肋骨对数关联分析发现112bp突变位点插入一个约289bp突变与肋骨对数变异具有关联。沈瑞玲等研究枣庄黑盖猪群体中VRTN基因ins291突变位点缺失型为优势基因型。欧阳子璇研究表明SSC7上的VRTN基因NV123 ins291位点对杜长大三元杂交猪的胸椎数影响极显著。张文克通过对松辽黑猪和杜长大三元杂交猪进行肋骨对数表型值相关分析，发现VRTN基因112bp位点插入的突变与肋骨对数表型变异存在关联性。这与本研究的VRTN基因ins291bp位点处极显著影响商品猪杜长大三元杂交猪群体个体肋骨对数（P＜0.01），并且呈现QQ型＞Qq型＞qq型趋势，QQ个体肋骨对数比qq型多1.24对以上，结果相符。
本研究在不同品系种猪中发现，长白种猪群中有利等位基因Q基因频率为A系＞B系；大白种猪群中有利等位基因Q基因频率为A系＞B系；有利等位基因Q频率为：杜洛克种猪群中BC系＞C系＞AC＞B系。以QQ为优势基因的A系长白、A系大白、BC系杜洛克和C系杜洛克种猪可用于生产多肋商品猪。
