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猪场又出现一种可引起母猪共济失调、流产或突然死亡的新疫病

猪业科学 2019-04-11

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帕病毒病(NVD)是由尼帕病毒引起的一种新的人畜共患病毒性疾病
  帕病毒病(NVD)是由尼帕病毒引起的一种新的人畜共患病毒性疾病,于1997年在马来西亚森美兰洲双溪尼帕城首次发现,是继疯牛病、口蹄疫、禽流感后又一引起世界各国广泛关注和恐慌的人畜共患病。生猪感染该病毒后,出现发热、呼吸困难及脑炎症状;母猪感染该病毒后表现为共济失调等神经症状,可能会导致流产或突然死亡;人感染该病毒后发生病毒性脑炎而死亡。由于其引起人感染后的高死亡率,缺乏有效的疫苗和治疗方法,因此世界动物卫生组织(OIE)和我国农业部都将其列为生物安全4级病原体。
 
  1、概况
 
  尼帕病毒病是由副黏病毒科亨尼帕病毒属(Henipavirus)的尼帕病毒(NiV)引起的一种人畜共患传染病。NiV是新发现于蝙蝠的一种副黏病毒,1999年3月初,从SungaiNipah村1名脑炎患者的脑脊液中分离到了一种新的副黏病毒,并确定为该次暴发的病原,因此命名为尼帕病毒(Nipahvirus)。血清学检测显示,家养动物如狗、猫、马和山羊均可感染尼帕病毒,但猪是其他家养动物的传染源。尼帕病毒可感染不同年龄的猪,从1998年马来西亚暴发尼帕病毒病以来,已造成许多人和猪伤亡,引起了巨大的社会恐慌,并给养猪业造成严重的经济损失。
 
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  2、实验室诊断技术
 
  2.1病原学检测
 
  2.1.1NiV分离鉴定
 
  NiV能够在多种培养细胞中生长并快速增殖至较高的滴度。非洲绿猴肾细胞和兔肾细胞RK-13细胞系对NiV尤为敏感。通常在病毒感染3d内能够观察到病毒病变效应(CPE),但一般来说在细胞上传代2次,每次5d所达到的分离效果更为稳定。经低毒量稳定传代后的病毒再次感染细胞后24~48h,细胞出现以形成合胞体为特征的CPE,并且感染早期,合胞体中所有细胞核位于合胞体中央,而晚期则被运送至合胞体外,并聚集在其周围。由于NiV在体外细胞培养中扩增迅速,并且能产生大量的病毒抗原,所以采用免疫荧光或免疫电镜法检测分离培养该病毒,最为方便快速。
 
  2.1.2分子诊断技术
 
  NiV的基因组全序列已被测出,研究者们可以在此基础上针对NiV的分子诊断技术进行相应的研发。目前,已经被报道的针对NiV的分子检测技术有2种,分别为荧光定量RT-PCR和双重套式RT-PCR。
 
  2.1.2.1荧光定量RT-PCR
 
  该方法敏感度高、特异性强,并且不需要接触活的感染性病毒,具有生物安全性的优势。其检测灵敏度可以达到1个空斑形成单位(PFU),并且有被学术界普遍认可的相关引物和探针有:
 
  5′-TCAGCAGGAAGGCAAGAGAGTAA-3′(Primer1),
 
  5′-CCCCTTCATCGATATCTTGATCA-3′(Primer2),
 
  5′-6FAM-CCTCCAATGAGCACACCTCCTGCAGTAMRA-3′(TaqManprobe),为NiV的实验室快速诊断提供了技术支持。
 
  2.1.2.2双重套式RT-PCR:
 
  Wacharapluesadee等描述了一种带有内参的双重套式RT-PCR检测技术。该技术能够用于对果蝠尿样的检测,并且加入内参大大降低PCR相关的抑制因素带来的假阴性的结果,提高检出准确率,在NiV流行病学调查时大大提高NiV监测数据的可靠性。
 
  2.1.3其他诊断技术
 
  主要针对NiV全病毒抗原或病毒主要致病抗原(如F蛋白和G蛋白等)制备特异性的病毒抗血清或单克隆抗体,在此基础上建立病毒中和试验、免疫组化以及免疫荧光等方法检测NiV相关抗原。病毒中和试验主要包括传统的空斑抑制试验、微孔板中和试验以及免疫空斑试验3种,分别通过计算空斑形成单位(PFU)、组织培养半数感染量(TCID50)以及病灶形成单位(FFU)达到检测病毒抗原或抗体的目的。检测NiV的病毒中和试验需要在BSL4级生物实验室进行,但近年来研究者们陆续开发了几种实验室检测技术,能够将检测NiV的生物安全水平降低至BSL2级,为偏远地区NiV检测提供了帮助。由于NiV原发于血管内壁,所以病死畜的多个器官均可用于免疫组化的检测,尤其是肺脏。
 
  目前,研究者们已经针对NiV的免疫组化法检测研发了几个检测体系,为该病毒的实验室检测提供了技术支持。
 
  2.2血清学检测
 
  鉴于NiV的生物危害性,用于该病毒血清学诊断的所有血清样品必需进行安全化处理,以尽量减少实验室工作人员接触NiV的风险。可以用6kGy的γ射线辐照或含0.05%Tween20和0.5%Triton—X100PBS(磷酸缓冲液)1/5稀释后56℃30min灭活的方法对血清样品进行前处理。目前常用的NiV的血清学检测方法包括病毒中和试验和ELISA试验。
 
  2.2.1病毒中和试验
 
  目前针对NiV抗体检测的病毒中和试验已经有相关的标准方法,Kaku等人利用基因重组技术构建了共表达NiVF或G蛋白与绿色荧光蛋白(GFP)的重组水泡性口炎病毒,作为已知病毒抗原检测NiV血清样本,用该重组病毒作为已知病毒抗原的好处在于GFP是可见的,可以在荧光显微镜下直观地数出荧光斑点的数量而获知血清样品中NiV特异性抗体的含量。该方法要比传统的中和试验更为迅速、安全和灵敏。Tamin同样也利用基因重组技术构建了单独表达F或G蛋白的重组水泡性口炎病毒作为已知抗原,检测NiV抗体,并在此基础上建立了检测NiV抗体的空斑抑制试验。
 
  2.2.2ELISA
 
  目前,针对NiV抗体检测的ELISA技术已经开发出间接ELISA和捕获ELISA2种。Daniels在1999年召开的国际猪病监测会议中提出了一种用非离子去污剂处理NiV感染的细胞以获得ELISA检测用NiV抗原的方法,随后,为消除ELISA的非特异性,研究者们又在此基础上加入了非感染细胞作为对照。美国疾病控制中心开发出能够检测针对NiVIgG和IgM2种亚型免疫球蛋白的ELISA技术。此外,Yu等人也报道过用NiVN蛋白作为病毒抗原检测IgG和IgM2种亚型免疫球蛋白的ELISA方法。
 
  3、防控措施
 
  目前对该病尚无有效的药物和治疗方法,只能采取强制措施,监测并淘汰患病动物,以免传染给人;防止家猪与野猪的接触;禁止运输和进口患病猪及其肉制品;对猪舍进行消毒,搞好清洁卫生工作。人感染后,用广谱抗病毒药Ribavirin(利巴韦林),可减少发烧时间,缓解发病程度,降低急性脑炎死亡率。随着科学家对这一病原的不断了解,人们利用疱疹病毒为载体进行F、G融合蛋白克隆,并在大肠杆菌中进行表达,有可能用来防治尼帕病毒的感染,其他相关的疫苗正在研究开发中。
 
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