不同PEDv交叉保护评价：选用流行毒株是猪场PED防控成功的关键

猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDv）自20 世纪 70 年代在欧洲育肥猪群被发现以来，该病毒逐渐从原始经典CV777毒株（G1a）开始出现变异和重组，先后在亚洲和美洲出现G2a、G1b和G2b毒株，造成严重的经济损失。早在上世纪90年代就已经开始使用PED疫苗，随着疫苗的广泛使用，PEDv造成的损失有所减轻，但时至今日，PED仍是对仔猪危害最严重的疾病之一。尽管PEDv仍然只有一个血清型，但不同基因型之间的主要抗原表位发生变异，导致PED疫苗交叉保护不足。基于此，对于不同PEDv毒株间的交叉保护能力是评价本场PEDv疫苗有效性的重要指标。

一、PEDv异质性

冠状病毒拥有最大的RNA基因组。尽管如此，它们仍能保持其大基因组的稳定性和高保真度复制，同时产生适应和退化所需的遗传多样性。这些特质归功于Nsp14基因表达的外核糖核酸酶的校对活性。鉴于冠状病毒的高保真性，PEDv积累了病毒适应性所需的突变或重组事件后实现了缓慢的进化。基于单个基因或者全基因组的进化树分析是解密不同毒株之间的亲缘关系的重要武器。在PEDv的遗传进化研究中，全长S基因及其S1部分 (aa 1-735) 被认为是用于研究PEDV的遗传相关性和分子生物学的合适位点。尽管报道了PEDV仅有一种血清型，但S基因的系统发育研究表明，PEDV可以分为两个种群：经典株的GI群和流行毒株的G2群，每个种群内又可分为两个亚群，即G1a、G1b、G2a和G2b。

G2群S基因长4161bp，编码1386个氨基酸，相较于G1群长9个碱基，并且展示出独特的遗传特征，即S基因出现插入与缺失：55、56、135和136位点存在4个氨基酸的插入，N端S蛋白高变区的160和161号位点存在2个氨基酸缺失，不同国家的分离株在该区域出现插入与缺失的位置会不一样。

G1b群在遗传特征上与G1a和G2群都不一样，尽管该毒株分离自流行区域，但它们不包含G2群典型的遗传特征。通过对S基因比对发现，该毒株与经典毒株S基因N端前1/3序列的同源性超过95%，但在该位置与G2群的同源性却低于89%，令人差异的是在剩下2/3序列中，该毒株与G2群的同源性则达99%。此外通过全基因组测序表明，该毒株的亲缘性与G2群更近。总体来说，以上数据表明，新的G1b变异株似乎是由经典G1a和G2群之间的组合事件引起的，可能是在病毒sg mRNA转录期间发生的，这很可能在中国发生。

二、PEDv的交叉保护评价

1. 细胞免疫荧光法评估抗血清对不同毒株的抗原交叉反应

分别以PC22A株（G2b）、S indel株（G1b）、PC177株（G2b细胞适应株）和CV777株（G1a经典株）的抗血清对上述四个毒株进行细胞免疫荧光试验。结果显示PC22A株抗血清对PC22A株、S indel株以及PC177株的结合抗体滴度达1：2560，而对CV777株的抗体滴度仅为1：640；S indel和PC177株抗血清对各个毒株的结合抗体滴度均几乎无差别；在此值得注意的是CV777株抗血清对三个变异株的结合能力稍差仅为1：160，而对同源的CV777毒株结合能力达1：640。该试验表明变重组毒株和变异毒株的细胞适应株抗血清对各种PED毒株的中和能力良好，但经典毒株抗血清对变异毒株的中和能力欠佳。

图2A 使用超免疫或恢复期猪PEDV抗血清通过CCIF评价各种PEDV毒株之间的抗原交叉反应

2. 细胞免疫荧光法评价单克隆抗体对不同毒株的抗原交叉反应

分别以PC22A株和经典株DR13的S蛋白和N蛋白单克隆抗体评估四种毒株的抗原交叉反应。结果显示PC22A株的S蛋白单克隆抗体检测到同源的PC22A抗体滴度最高（1：40960），而经典株DR13则差很多（1：2560）；PC22A株的N蛋白单克隆抗体检测到各个毒株的抗体滴度均几乎一致。

图2B 使用单克隆抗体通过CCIF评价各种PEDV毒株之间的抗原交叉反应

3. 荧光聚焦中和法评价抗血清对不同PEDv毒株的中和反应

分别以PC22A株高免血清、S indel株抗血清、PC177株抗血清以及CV777株抗血清对各个毒株进行中和试验。结果显示PC22A株高免血清对于变异毒株（PC22A株、S indel株以及PC177株）的中和能力突出，均达1：1024，而对经典株的中和能力较弱，仅为1：64；S indel株抗血清对S indel株和PC177株中和能力显著强于PC22A以及CV777株；PC177株抗血清对各个毒株的中和能力均几乎一致；CV777株抗血清则对同源毒株和其他三个毒株的中和能力差异显著，中和滴度达16倍。

图3 通过荧光聚焦病毒中和试验测定四种PEDV菌株的中和抗体滴度

S蛋白是PEDv表层的纤突蛋白，亦是最主要的抗原蛋白和毒力蛋白。同时S基因存在高变区，在漫长的遗传进化过程中，高变区逐步变异，PEDv出现不同的亚型。不同亚型的出现往往意味着毒力发生着变化，从最早欧洲发现的毒株至90年代流行的亚洲毒株以及2010s和2013年在中国和美国流行的毒株，每个阶段主要抗原表位发生变异，毒力逐步增强。鉴于此，如何从众多毒株中筛选出免疫原性好、交叉保护能力强的毒株是腹泻防控成功的关键因素。美国的研究人员基于细胞免疫荧光法和荧光聚焦中和试验评价了美国流行毒株、重组毒株、细胞适应毒株以及经典毒株之间的交叉保护效果，结果表明流行毒株（G2b）对现有流行的毒株交叉保护效果好，而经典毒株对现有流行毒株的交叉保护不足。因此，选用流行毒株是猪场PED防控成功的关键。

总结

1、G2b毒株对G1b和G2b细胞适应株的交叉保护能力强

2、G1a经典毒株对G2b株、G1b和G2b细胞适应株交叉保护能力弱