天福清免疫怀孕母猪后产生更高的针对G2b基因型PEDV流行毒株的中和抗体

PEDV目前只有一个血清型, S基因通常用于评估冠状病毒的遗传多样性，根据S基因编码的氨基酸N端的不同，PEDV被分为两大基因群，G1型(G1a、G1b)和G2型( G2a、G2b)。回顾性来看，2010年之前,亚洲和欧洲绝大多数的 PEDV 都属于 G1a 基因型。而2010年-2015年间，主要流行毒株为G2b基因型，2015年至今，主要流行毒株为G2a基因型。

毋庸置疑，猪群同时存在G2a基因型和G2b基因型的的情况也非偶然，尤其是对于超大规模的养猪企业，往往应该思考的是如何同时应对G2a基因型和G2b基因型流行毒株。另一方面，商品化的PEDV疫苗，不论是活苗还是灭活苗，都只含有一个基因型的疫苗毒株。因此，对一个商品化疫苗的效果评估，不仅仅要考虑其对于同源毒株的保护力，而且要评估对于异源毒株的交叉保护力。

在所有上市的PEDV疫苗中，天康PEDV灭活疫苗“天福清“是唯一疫苗毒株为G2a基因亚型的PEDV疫苗，对于日益增多的G2a基因亚型的流行毒株提供的同源保护非常确实，但是，对于日益减少的G2b基因亚型的PEDV毒株是否有足够的交叉免疫保护，需要探究。

为此，PEDV野毒阴性场的头胎妊娠母猪，分别免疫天福清（G2a基因型）与A公司产品(先免疫活苗，后免疫灭活苗)（都是G2b基因型），二免后采集血清用G2b基因型毒株进行血清中和抗体测定试验。

结果表明

1.G2a基因型的PEDV灭活苗（天福清）免疫怀孕母猪后产生更高的针对G2b基因型PEDV流行毒株的中和抗体。

2. G2a基因型的PEDV灭活苗（天福清）对G2b基因型PEDV疫苗的异源强化免疫产生的中和抗体水平高于G2b基因型PEDV疫苗对G2b基因型PEDV疫苗的同源强化免疫产生的中和抗体水平。

无独有偶。2019年中国农业科学院兰州兽医研究所张永光和王永录研究员团队使用G2a（CH/HBXT/2018）和G2b（CH/HNPJ/2017）两种基因型PEDV灭活疫苗接种乳猪，并比较它们的免疫原性和交叉保护效果。研发发现：G2a基因型的灭活疫苗能够保护所有仔猪（8/8）免受同源（G2a）和异源病毒（G2b）的攻击，而G2b基因型的灭活疫苗仅保护2/4和1/4仔猪免受同源（G2b）和异源（G2a）病毒的攻击。

摘要

在华北某大型PEDV野毒阴性场，对怀孕母猪免疫了一种G2a基因型PEDV灭活疫苗（天福清，天康制药），采集产后5天母猪的血清和所生仔猪5日龄血清，用G2b基因型PEDV流行毒株测定血清中和抗体。

试验材料和分组

分娩日龄接近的怀孕母猪100头，随机分为2组，每组50头，在产前40天和产前20天分别免疫：天康组（天福清，G2a基因型PEDV灭活苗）；A公司组（猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗和灭活苗，活苗和灭活苗都是 G2b基因型）。

试验方法

用实时荧光RT-PCR方法检测试验过程中各阶段粪拭子。用G2b基因型毒株进行各组免疫血清的中和试验，比较各试验组的一免前和分娩后5天母猪血清、5日龄仔猪血清中的抗体滴度，来比较天康组和A公司组对G2b基因型毒株的中和抗体水平。

试验结果

1.粪拭子结果全部为阴性；

2.天福清组（G2a基因型疫苗株）所产生的中和抗体是A公司组（G2b基因型疫苗株）所产生的中和抗体的3.2倍。

试验结论

1.基于G2a基因型的PEDV灭活苗（天福清）免疫怀孕母猪后产生更高的针对G2b基因型PEDV流行毒株的中和抗体。

2. G2a基因型的PEDV灭活苗（天福清）对G2b基因型PEDV疫苗免疫后再加强免疫产生的中和抗体水平显著高于G2b基因型PEDV疫苗对G2b基因型PEDV疫苗本身免疫后再加强免疫产生的中和抗体水平。

关键词：天福清，G2a基因型，G2b基因型，血清中和试验，免疫交叉保护，流行毒株

01引言

猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）引起猪的腹泻、呕吐、脱水及对仔猪高致死率的一种接触性肠道传染病。1976年，该病在我国首次被报道，2010年以来呈大范围暴发流行。PEDV可感染各年龄段猪，特别是哺乳仔猪，较低剂量PEDV就能引起仔猪发病，成年猪感染 PEDV 后通常表现较温和的疾病症状，发病状态不明显。PEDV基因组为单股正链RNA，全基因组长约28 kb，主要结构蛋白为纤突糖蛋白(S)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和核衣壳蛋白(N)。

PEDV目前只有一个血清型, S基因通常用于评估冠状病毒的遗传多样性，由于在S基因编码的氨基酸N端的不同，PEDV被分为两大基因群，G1型(G1a、G1b)和G2型( G2a、G2b)，2010年之前,亚洲和欧洲绝大多数的 PEDV 都属于 G1a 基因型。2010年-2015年间，主要流行毒株为G2b基因型，2015年至今，主要流行毒株为G2a基因型。而且，据华中农业大学肖少波团队流调发现，在2021年，133份PEDV临床样本测序分析，其中G2a基因型110份，占比82.7%。刘雨桐等在2020-2021年间对我国西南地区PED的流调发现，主要流行的毒株为G2基因型，包括G2a、G2b、G2c 3个亚型。颜忠等对我国11个省市318个规模化猪场的PEDV监测分析发现G2a基因亚型毒株为2018－2020年流行的主要毒株类型。杨春杰在2021年对免疫了G2b亚型疫苗株而发病的广西某规模化猪场的PEDV分离鉴定分析为G2a基因亚型[1-6]。

天康生物制药有限公司的天福清的疫苗株为G2a基因亚型，对G2a基因亚型PEDV流行毒株有着天然的保护优势，但是，对G2b基因亚型的PEDV流行毒株是否有足够的交叉免疫保护，值得探究。

为此，选用一个PEDV野毒阴性场的头胎妊娠母猪，使用天康PEDV灭活疫苗天福清（G2a基因型）与A公司产品(活+死)（G2b基因型）组疫苗做免疫对比，采集血清后，用G2b基因型毒株进行中和试验。

02材料和方法

2.1疫苗和血清中和试验所用毒株

3种不同类型的商品化PEDV疫苗，A公司灭活疫苗，G2b基因型疫苗株：猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗，灭活前猪传染性胃肠炎病毒含量≥107.5TCID50/ml，猪流行性腹泻病毒含量≥107.3TCID50/ml，4℃储存；A公司活疫苗，G2b基因型疫苗株：猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗，每头份两种病毒的含量均≥105.0TCID50，-20℃储存。

天康生物制药有限公司PEDV灭活苗，天福清，G2a基因型疫苗株：XJ-DB2株，灭活前病毒含量≥108.0TCID50/ml，4℃储存，产品保质期18个月。

SXJZ-1毒株为田间分离野毒，为某农业大学保存，经S基因测序分析和遗传进化分析属于G2b基因型，用于本试验中血清中和试验。

2.2动物分组和免疫

本试验在华北某大型猪场进行，所选试验用头胎妊娠母猪的粪拭子通过RT-PCR检测，确定为PEDV阴性猪只。根据饲养管理相同、胎次相同、同一栋舍的原则，选择了100头预产期相近的妊娠母猪分成2组，1.天康组，50头妊娠母猪，产前40天和20天各免疫一次天福清，肌肉注射2 ml/头/次；2.A公司组，50头妊娠母猪，产前40天一免活疫苗，肌肉注射1头份/头，产前20天二免灭活苗，肌肉注射2 ml/头。具体分组及免疫方案见表1。

2.3样品收集

血清样品，各组随机选取20头试验母猪打上耳标，采集一免当日母猪血清，采集分娩后5天母猪血清时，同时采集对应所产5日龄仔猪血清，按组别做好标识，检测前-20℃保存。

粪拭子样品，从一免当日至免疫后5日，连续采集粪拭子，按组别做好标识，检测前-20℃保存。

2.4粪拭子的实时荧光RT-PCR检测

粪拭子样品按照国测生物RNA小量试剂盒说明书抽提PEDV总病毒RNA，然后用实时荧光RT-PCR进行检测，反应体系为：20μL反应液，5μLRNA，反应条件为：50℃反转录30min，95℃预变性2 min，95℃变性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸10 s，40个循环。

2.5血清中和试验

将待检血清、阳性对照血清和阴性对照血清56℃水浴灭活30分钟。用MEM（含10µg/ml胰酶）对灭活后的待检样品、阳性对照和阴性对照血清在96孔U型板内进行2倍（1︰2、1︰4、1︰8、1︰16、1︰32…1︰256稀释）系列稀释。每个稀释度4孔，每孔100µl。用MEM（含10µg/ml胰酶）将检验用病毒稀释成病毒含量为200TCID50/0.1ml的病毒液。将稀释好的病毒液按每孔100µl加到含有血清的96孔U型板中，置37℃ 5% CO2培养箱内中和1小时。取培养24~48小时的96孔培养板细胞，弃去培养液，将中和1小时的病毒与血清的混合物转移至96孔培养板相应的孔内，每孔100µl，置37℃ 5% CO2培养箱中培养并观察5天。

03结果

3.1粪拭子检测结果

第一批采集的147份粪拭子样品为一免前1天至分娩后3天的母猪粪拭子，每6-7份混成1份检测，共计24份混样，RT-PCR检测结果全部显示为阴性，详见表2和图1。

图1 第一批粪拭子实时荧光RT-PCR曲线图

第二批采集的156份粪拭子为母猪分娩后5日及5日龄仔猪的粪拭子，根据组别不同为28份混样，RT-PCR检测结果全部显示为阴性，详见表3和图2。

图2 第二批粪拭子实时荧光RT-PCR曲线图

3.2血清中和抗体水平对比结果

二免后25天，即母猪分娩后5天血清，天福清组中和抗体水平为1357，A(活+死)组中和抗体水平为422，两者相差3.2倍（即1357/422可得），虽然天福清组与A(活+死)组的母猪血清中和抗体水平比一免前都有显著升高，但是天福清组与A(活+死)组之间存在显著差异。

哺乳仔猪体内抗体主要是通过吮吸乳汁获得，则所分娩5日龄仔猪血清方面，天福清组中和抗体水平为871，A(活+死)组中和抗体水平为306，两者相差2.8倍（即871/306可得），天福清组与A(活+死)组之间存在显著差异。（见图3）

图3血清中和抗体水平的比较（母猪一免前，n=20每组；母猪分娩后5天，n=15每组；5日龄仔猪，n=5每窝），用血清中和试验法检测血清中和抗体水平，表示方法为对PEDV感染有抑制作用的平均血清稀释度的倒数。

04讨论

本次试验全程通过粪拭子PEDV的RT-PCR检测结果可知，可以判断本试验猪群从后备猪驯化阶段到本次试验结束都没有接触过PEDV野毒感染，于是我们可以推定两个试验组的母猪和对应仔猪的血清中和抗体水平完全来自于疫苗的免疫反应。

美中不足的是，试验猪群是外购阴性后备猪，在后备猪驯化阶段免疫过某公司的PED活疫苗和灭活疫苗（G2b基因亚型），而且免疫前天福清组中和抗体水平比A组(活+死)略高（高1倍）。因此，本试验严格意义来说是个强化免疫效果对比试验。

从母猪强化免疫前后血清中的中和抗体的差异对比可知，免疫前的差异（差1倍）被强化免疫被放大了（差3倍），证明了天福清（G2a基因型疫苗株）对后备母猪接种G2b基因型疫苗后诱导的免疫反应产生了更好的强化免疫。与母猪血清中和抗体差异趋势一致的是，两个试验组对应的仔猪的血清中和抗体差异显著（差2倍）。所以，G2a基因型的PEDV灭活苗（天福清）对G2b基因型PEDV疫苗的异源强化免疫产生的中和抗体高于G2b基因型PEDV疫苗对G2b基因型PEDV疫苗的同源强化免疫产生的中和抗体。

天福清组与A组(活+死)二免免疫后的针对G2b流行毒株的中和抗体的差异来源可能包括疫苗抗原含量、疫苗毒株基因型、疫苗佐剂、疫苗性质（死+死，和活+死）等因素，需要进一步设计严谨的试验来细分差异的真正来源。

灭活疫苗免疫后产生的中和抗体水平很大程度上依赖于抗原含量，抗原含量越高，中和抗体就越高，临床保护就越好，这是一个普遍接受的观点。据我们所知，天福清是目前为止抗原含量最高的PEDV灭活苗。

2019年2月11日，中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室、农业部动物疫病病原生物学重点实验室张永光研究员、王永录研究员团队使用G2a（CH/HBXT/2018）和G2b（CH/HNPJ/2017）两种基因型PEDV灭活疫苗接种乳猪，并比较它们的免疫原性和交叉保护效果。研发发现：G2a基因型的灭活疫苗能够保护所有仔猪（8/8）免受同源和异源病毒的攻击，而G2b基因型的灭活疫苗仅保护2/4和1/4仔猪免受同源和异源病毒的攻击。基于G2a毒株的候选灭活疫苗在开发针对当前高致病性流行性PEDV毒株的有效疫苗方面更有希望[7]。据我们所知，天福清是目前为止唯一的基于G2a基因亚型的PEDV灭活苗。

PEDV流行毒株之间的重组是常态化发生的事件，也是导致疫苗免疫失败的一个重要因素[8]，田间使用PEDV弱毒活苗是否会与流行毒株产生重组，尽管是个未被广泛证实的假设，但是，只需看看蓝耳疫苗毒株和田间流行毒株的重组报道，就应该有理由相信这是完全有可能的。此外，PEDV通过胎盘垂直传播已有报道，在新生仔猪的睾丸组织和PEDV阳性母猪的脐带中发现了PEDV，提示PEDV的传播途径比我们想象的更加多样化。这些新的信息都提醒我们有必要对目前猪场中怀孕母猪大量使用活苗接种或者病毒返饲的合理性和可能带来的隐患进行重新审视。

的确，越来越多的养猪企业在怀孕母猪上停止使用了PEDV活苗。也有部分企业开始探索，在良好的生物安全的加持下，彻底停止返饲和活苗的使用，猪群只用PEDV灭活苗，来减少PEDV活苗或者活毒不可避免的散毒和可能存在的垂直感染，更好的实现猪瘟PEDV野毒的日常监测和阴性状态的维持。

05作者简介

刘武刚

执业兽医师

华中农业大学预防兽医学硕士

在天津宝迪、正邦等集团从事猪群健康管理、生产技术管理和兽医团队管理工作近十年，对猪场生物安全体系搭建及猪呼吸道相关疾病和腹泻疾病积累了丰富的经验。现任天康生物制药有限公司技术服务经理，乳源免疫力推广大使。