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1、前 言
2017年12月25日，天康生物制药有限公司历时10年时间研发的中国第一个猪瘟E2基因工程亚单位疫苗-“天瘟净”获得农业农村部颁发的国家二类新兽药证书。天瘟净上市后凭借其独特的产品优势、良好的应用效果深受用户的青睐，为经典猪瘟的深度防控和净化提供了新的工具和方案。
按照《国家动物疫病强制免疫指导意见（2022—2025年）》要求，中国动物疫病预防控制中心组织制定了《2022年国家动物疫病免疫技术指南》，基于监测数据对2022年猪瘟流行趋势进行了预判， 并根据在售猪瘟疫苗产品推荐了相应的免疫程序，具体内容如下：
（一）流行趋势
当前，猪瘟主要在东南亚、中南美洲和东欧等地区流行。我国猪瘟控制程度好，呈平稳态势，流行率极低。临床上，以散发性疫情和猪场的非典型病例和个体感染为主。从监测数据来看，猪瘟病毒在猪群中的感染率低，与前两年的监测数据基本相当，免疫状况总体较好。
基于监测数据，预判 2022 年猪瘟临床仍以点状发生、非典型病例以及个体感染为主，不会发生暴发性或区域性疫情，不排除小范围、局部或零星疫情发生的可能。猪瘟疫苗免疫合格率低且存在猪瘟病毒污染的猪场，特别是生物安全体系缺失或不完善的中小型猪场，有疫情发生风险。
（二）疫苗选择
选择使用猪瘟活疫苗或亚单位疫苗。
（三）推荐免疫程序
1. 猪瘟活疫苗
商品猪：21～35日龄进行初免，60～70日龄加强免疫一次。
种公猪：21～35日龄进行初免，60～70日龄加强免疫一次，以后每6个月免疫一次。
种母猪：21～35日龄进行初免，60～70日龄加强免疫一次，以后每次配种前免疫一次。
2. 猪瘟亚单位疫苗（以天瘟净为代表）
种公猪和种母猪：一年免疫 2 次。
商品猪：一年免疫 1 次。
（四）免疫效果监测
1、检测方法
采用 GB/T 16551-2020《猪瘟诊断技术》规定的 ELISA方法进行抗体检测。
2、免疫效果评价
免疫 21 天后，抗体检测阳性判为个体免疫合格。免疫合格个体数量占免疫群体总数不低于 70%的，判定为群体免疫合格。
从猪瘟免疫技术指南中可以明确采用猪瘟亚单位疫苗进行免疫防控，可以减少种猪、商品猪的免疫次数，降低猪场免疫负担，但不影响免疫防控效果。作为中国第一个猪瘟E2亚单位疫苗，从被质疑到被越来越多的客户、同行认可，用了近2000个日日夜夜，走过了中国的万水千山，获得了一份份优异的抗体报告，赢得了一个个忠实的客户订单。
以下从天瘟净产品的孕育、诞生、问世、市场推广和应用、猪瘟的深度防控和净化、产品的再度创新等维度进行全面的回顾，一起探寻这个出类拔萃、名不虚传的产品的前世今生吧。
2、天瘟净的孕育和诞生
（一）天瘟净的孕育
猪瘟是严重危害养猪业的重要传染病，世界动物卫生组织（OIE）规定为必须报告的动物疫病之一，在我国被列为“一类动物疫病”，是我国计划要消灭的重大动物疫病之一。
据专家估计，猪瘟导致中国猪的平均发病死亡率在2% ~ 5%，据此推算的直接经济损失每年就超过20亿元人民币，在生产实践中有很多猪病的发生与猪瘟病毒感染有关，这样的链接效应产生的损害不可估计。
我国在20世纪50年代成功研发的享誉世界的猪瘟兔化弱毒疫苗（又称C株），在全国范围大规模地推广和应用，并在2007年将其纳入国家动物疫病 强制免疫计划，有效地遏制了猪瘟大规模的流行，猪瘟的发病率和死亡率也逐年降低。C株疫苗的大规模免疫收获了很好的成效。但是必须清醒地认识到猪瘟并没有被完全消灭，在部分免疫密度不够的地区猪瘟呈点状散发流行。
长期、高密度的猪瘟活疫苗免疫预防不仅存在疫苗毒与野毒重组或进行自然突变而造成毒力返强的风险，而且存在免疫耐受的现象，在某种程度上促进了猪瘟病毒的逃逸性变异，以引起非典型症状及繁殖障碍为主要特征的基因2.1亚型毒株逐步取代了1.1亚型，成为当前我国猪瘟病毒的优势流行毒。
此外，由于当时生产猪瘟活疫苗的企业众多，工艺繁冗、复杂，质量控制系统不全面、方法落后，导致疫苗有效性不稳定，猪场经常需要以2-3倍剂量进行多次接种，而且要求在-15℃以下环境中保存，对冷链运输、保存及稀释的温度要求极为严苛，易用性差。
更进一步的，猪瘟活疫苗不具有标记特性，无法通过血清学诊断区分猪瘟野毒感染猪和免疫猪，给猪瘟的净化造成了较大的困难。
2007年8月30日随着《中华人民共和国动物防疫法（2007修订）》发布实施，猪瘟自2008年开始实施强制免疫。基于当时的猪瘟流行态势、疫苗制造水平及防控政策，天康生物高层领导预判到猪瘟净化将是国家动物疫病防控的长远规划之一，可提高养猪业的经济效益，并认识到采用基因工程技术研制安全性好、有效性稳定、易于临床使用、具有标记性，能够用于鉴别诊断的猪瘟亚单位疫苗势在必行，同年猪瘟E2亚单位疫苗项目正式立项。
2012年国务院办公厅发布的《国家中长期动物疫病防治规划（2012-2020）》和《全国兽医事业发展“十二五”规划 》明确猪瘟作为优先防治与重点防范的16种动物疫病之一，提出应当对我国猪瘟净化与防控提出指导性意见和具体的净化策略，进一步增强了天康生物制药研发团队在猪瘟E2亚单位疫苗项目上的信心和决心。
（二）天瘟净的诞生
猪瘟病毒E2糖蛋白是猪瘟病毒的主要结构蛋白之一，是诱导中和抗体及激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白，其免疫原性依赖于正确的蛋白空间构象（或糖基化），是研制亚单位疫苗的主要靶标。
昆虫细胞-杆状病毒表达系统不仅可以高效表达外源蛋白，而且能够进行糖基化、磷酸化、酰基化、正确的信号肽切割、蛋白水解以及适当的折叠等真核细胞转录后加工作用，将重组蛋白聚集定位在同一细胞器上，经适当的寡聚化装配，使表达产物在结构及功能上接近天然蛋白。
基于国内外学者近年来的研究报道，天康生物制药研发团队最终选择采用杆状病毒表达系统表重组E2蛋白，项目组下载了猪瘟病毒3个亚型的多个毒株的E2基因序列，最终以流行毒株的E2序列作参考，在C株E2基因基础上进行了密码子优化、修饰，将其重组于杆状病毒内，在昆虫细胞上培养重组杆状病毒，获得了分泌表达的猪瘟病毒E2重组蛋白。
此外，为了实现猪瘟E2亚单位疫苗的工业量产，项目组攻克了以下多个技术难点。
（1）采用了专利保护的病毒蚀斑克隆技术从近千个重组毒株中筛选获得了一株毒价稳定、表达量高的猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒工程毒株。
（2）通过筛选昆虫细胞培养基、改造反应器通气方式、优化接种细胞密度、搅拌速度、酸碱度、溶氧等工艺参数，实现了昆虫细胞无血清全悬浮培养，培养规模及技术均为国内领先。
（3）采用DOE优化了接毒细胞密度、病毒感染复数、病毒感染时间、收毒时间等参数，促进宿主细胞产生更多病毒粒子，建立了先进的抗原澄清工艺，完成了重组E2蛋白的大规模批量生产。
（4）佐剂是亚单位疫苗保护性免疫效力的必要策略，为保证疫苗免疫的安全性和高效性，项目组从市售的16种佐剂中筛选出一种综合表现最佳的进口植物油佐剂，并建立了在线多级剪切工艺，攻克了油包水疫苗制造的关键瓶颈，实现连续乳化生产，为猪瘟E2亚单位疫苗的制造打通了最后一环。
2017年12月，天康生物制药研发团队自主研发的中国第一个猪瘟E2基因工程亚单位疫苗（猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒灭活疫苗（Rb-03株），商品名：天瘟净）正式获得农业农村部颁发的二类新兽药证书。
这支队伍因猪瘟E2亚单位疫苗而生，专心致志、甘于寂寞、潜心治学、锲而不舍、精益求精，在实验室设计开展了近百次动物实验，用近千头试验猪，全面、充分地测试了猪瘟E2亚单位疫苗的安全性、有效性；在4个不同地区猪场的不同猪群上完成了多轮临床试验，获得了丰富的应用数据，历经10年打磨，制造出一问市便在业内广受赞誉的猪瘟E2亚单位疫苗，填补了国内技术空白。
紧随天康之后，多家传统猪瘟活疫苗生产企业也开展了同类产品的研发和申报工作，截止到2021年底，国内市场已经有了3家企业提供猪瘟E2亚单位疫苗。但通过临床试验对比发现，天瘟净不仅仅是国内第一个猪瘟E2亚单位疫苗，而是当前最好的猪瘟E2亚单位疫苗。究其原因，在于研发团队独具匠心设计赋予了天瘟净产品的独特价值：
（1）抗原设计精巧
比较了猪瘟病毒3个亚群多个毒株的E2基因的核苷酸和氨基酸序列，根据密码子的简并性，最大限度地提高合成蛋白与经典毒株、流行毒株氨基酸的同源性，在保证良好免疫原性的基础上拓宽了天瘟净的保护谱。
（2）表达体系合成精“准”
使用真核生物表达系统表达目的蛋白，具有正确的糖基化修饰，展现完整的抗原生物学功能。
（3）无血清全悬浮细胞培养工艺、抗原稳定性、免疫原性好
采用无血清全悬浮细胞培养工艺生产重组蛋白，抗原中有效蛋白含量高、纯度高，以二聚体为主，免疫原性更好。
（4）抗原释放缓慢，诱导产生高滴度抗体
选用进口定制的植物油佐剂，配合独创的乳化双剪切工艺，可以有效延缓重组E2蛋白在机体内的存留时间，使之持续、缓慢释放，而且可以增强巨噬细胞的吞噬与杀菌能力，提高免疫应答效果，从而诱导机体产生高滴度抗体、延长免疫持续期。目前该疫苗免疫持续期280日，母源抗体持续期10-12周，显著高于猪瘟活疫苗。
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