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为探索口蹄疫、猪瘟、伪狂犬病疫苗联合免疫在猪场中的临床应用，研究进行了实验室和猪场临床效果评估，通过实验室对疫苗混合后的物理性状、疫苗效价变化进行探讨，证明联合免疫的可行性；分别选取40日龄的保育猪(2500头)、后备母猪(1000头)、经产母猪(1000头)作为试验对象，将其分成5组（即：A、B、C、D、E组）通过检测口蹄疫、猪瘟、伪狂犬病抗体效价来评估猪群的临床免疫效果。结果显示，3种疫苗联合免疫后效果不受影响，免疫副反应率比较低，猪只免疫次数以及人猪接触频率显著降低，特别是猪群进行二免后抗体效价更高，免疫持续期不受影响，此次研究结果适宜临床推广。
为探索口蹄疫（FMD）、猪瘟（CSF）、伪狂犬病（PR）3种疫苗联合使用的可行性，切实提高基层免疫工作质量，降低劳动强度，减少工作量，提高口蹄疫、猪瘟、伪狂犬病免疫密度和免疫效果，降低动物疫病发生风险。孟丽军等做了大量活疫苗与灭活疫苗联合免疫方案的研究，疫苗接种操作时大部分用的是疫苗分点注射操作。而在临床上把相关疫苗先混合在一起，一次性免疫动物体效果跟踪报道较少，为了科学有效地研究联合免疫方案可行性，研究验证口蹄疫灭活苗稀释猪瘟、稀释伪狂犬病冻干苗，对溶解后的猪瘟、伪狂犬病苗效价及物理性状进行了详细的检测分析，具体检测项目：疫苗pH、半数细胞组织感染量（TCID50）、黏度、粒度、稳定性以及对CSF、PR荧光定量PCR活性分析，从而为制定联合免疫程序提供参考。
1 材料与方法
1.1 疫苗与试验猪只来源
口蹄疫灭活疫苗由金宇保灵生物药品有限公司提供（商品名：金OA）批号：18392243；猪瘟ST传代细胞苗由辽宁益康提供（商品名：瘟康）批号：201841；猪伪狂犬病耐热保护剂C株苗由扬州优邦提供（商品名：伪狂宁）批号：18251003，上述疫苗均按各自说明书的要求进行保存、运输。从广西玉林选取后备母猪（1000头）、陆川选取经产母猪（1000头）、桂林区域选取40日龄的保育猪（2500头）进行此次试验，选取的各类猪只大小基本一致，采用人工投料，猪只自由采食，自由饮水。试验日期为2019年6月1日—2020年2月1日，地点广西玉林、陆川、桂林区域的规模猪场。
1.2 主要试剂
口蹄疫O/A型液相阻断ELISA抗体检测试剂盒，由兰州兽医研究所生产，批号2019122401；猪瘟ELISA抗体检测试剂盒，IDEXX公司产品，批号433220-P361；猪伪狂犬病gB抗体ELISA试剂盒（ADV-gB），由荷兰BioChek百测公司提供，批号2331106；其他常规仪器均由国家兽用工程实验室提供。
1.3 疫苗稀释与检测
取2瓶猪瘟冻干苗，其中1瓶用20mL口蹄疫灭活苗复溶，复溶后于室温作用0h、1h、2h，分别用MEM溶液作10倍系列稀释进行TCID50检测；取3瓶猪伪狂犬病冻干苗，用10mL口蹄疫灭活苗进行复溶，复溶后于室温作用0h、1h、2h后分别用MEM溶液进行10倍系列稀释进行TCID50检测。
2 试验方案
2.1 联合疫苗理化性检验与疫苗活性评估
口蹄疫灭活苗稀释猪瘟、猪伪狂犬病冻干苗，对溶解后的猪瘟、猪伪狂犬病冻干苗效价、物理性状进行了详细的检测分析,具体检测疫苗pH、TCID50、黏度、粒度、稳定性以及对CSF、PR荧光定量PCR活性分析，从而为制定联合免疫程序提供参考。
2.2 试验猪场安全性和有效性评估
将试验保育猪只分成5组，A组、B组、C组为单针对照组，其中A组猪只仅免疫CSF疫苗，B组猪只仅免疫PR疫苗，C组猪只仅免疫FMD疫苗；D组、E组为联合免疫组，其中D组猪只免疫CSF+PR联合混合疫苗，E组猪只免疫FMD+CSF+PR联合混合疫苗。上述组别均需要在免疫前35日龄采血评估猪群抗体水平及健康程度，对40日龄保育猪一免后30d、二免后30d的免疫效果进行跟踪，免疫注射时给所有猪佩戴耳标。试验动物分组与免疫方案见表1。
2.3 统计分析
用SPSSStatistics20.0软件进行单因素方差分析，P＞0.05表示差异不显著，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。
3 试验结果与分析
3.1 实验室评估物理性质与疫苗活性
通过表2研究结果表明，用口蹄疫灭活苗复溶猪瘟、猪伪狂犬病冻干苗时，猪瘟冻干苗溶解较慢，基本在2～3min后才能够全部溶解，而猪伪狂犬病疫苗在1～2min内全部溶解；疫苗溶解后pH变化不大，基本在7.23～7.6之间；混合后的疫苗黏度在25.29～43.45CP范围内；混合后的疫苗通过粒度检测基本都是标准单峰，离心后没有出现分层，对猪瘟、猪伪狂犬病通过实时荧光定量PCR检测病毒含量无显著差异，说明使用口蹄疫灭活疫苗可以有效稀释猪瘟、猪伪狂犬病疫苗，而且猪瘟、猪伪狂犬病疫苗活性不受影响。
3.2 临床评估联合免疫效果
3.2.1 免疫应激反应观察
联合免疫推广区域猪只免疫后24h内个别区域有零星轻微应激，现场通过物理抢救和临床处理均未出现死亡现象，推广区域的大部分猪只均未出现精神沉郁、饮食减退和死亡等异常免疫反应情况，见表3。
3.2.2 口蹄疫抗体指标效果分析
通过表4和图1可知，口蹄疫抗体水平实验数据分析可知，猪群单独免疫口蹄疫疫苗二次抗体水平与疫苗混合组（口蹄疫+猪瘟+猪伪狂犬病）抗体水平差异不明显，说明单独免疫效果与联合免疫效果相当，即联合免疫组（口蹄疫+猪瘟+猪伪狂犬病）注入猪体后不影响口蹄疫免疫效果；通过一免后30d，二免后30d抗体数据分析可知，联合免疫组与单独免疫口蹄疫组，免疫持续期差异不显著（P≥0.05），特别是联合免疫组二免后30d效果几乎不受影响。
3.2.3 猪瘟抗体指标效果分析
通过表4和图2可知，猪瘟抗体分析可知，免疫前抗体水平与一免后30d，二免后30d差异不显著，组间比较，各组之间差异不显著（P＞0.05），说明联合免疫组不影响猪瘟免疫效果。
3.2.4 伪狂犬病抗体指标效果分析
通过表4和图3可知，对伪狂犬病抗体分析可知，联合免疫组一免，二免后效果与免前gB抗体水平差异显著（P＜0.05），说明免疫疫苗后伪狂犬病抗体快速提升，保护力提高。但从组间分析可知，联合免疫组（免疫口蹄疫+猪瘟+猪伪狂犬病组）抗体水平好于单苗免疫组。
4 讨论
猪瘟、口蹄疫、猪蓝耳病疫苗在同步免疫研究方面,国内的科研人员进行了较多的试验探索，也取得了一些成功经验。有些研究指出猪口蹄疫疫苗与猪瘟脾淋活疫苗可同时进行免疫，而猪口蹄疫不能与高致病性猪蓝耳病灭活疫苗进行同时免疫，3种疫苗不能同时免疫,存在相互干扰现象。陆国林、陈伟杰等试验结论提出了猪瘟、猪口蹄疫和高致病性猪蓝耳病灭活疫苗可同时分点免疫,相关研究还有很多，结论各有争论。
4.1 非洲猪瘟背景下，降低人猪接触的重要性
在非洲猪瘟肆虐的背景下，做好口蹄疫，伪狂犬病，猪瘟的免疫防控可以有效提高猪群的健康，提高易感动物的抵抗力，筑起抵抗非洲猪瘟的防线。有研究表明，相同感染剂量下，液体组和饲料组随着暴露次数增加，非洲猪瘟的感染概率也随之增加。当液体组的暴露次数达到10次时，最低感染剂量1TCID50的感染概率接近1。由此可见，减少免疫次数的同时减少人猪接触的次数，降低针头传播疾病的风险，大大降低非洲猪瘟感染的概率，多联多价、组合免疫是未来猪场免疫程序变化的必然趋势。
4.2 降低人猪接触，构建“一针多防”的组合免疫方案可行性
关于当前形势下的免疫重构需要有新的考量，非洲猪瘟常态化下如何减少猪群的应激，重构猪群的免疫程序。鉴于此，结合金宇丰富可靠的产品，提出了“一针三防”的理念，并在此基础上进行了大量的实验室验证及临床应用研究，结果发现，基于金宇产品线建立的“一针三防”效果非常理想。70日龄时免疫口蹄疫（口蹄疫首免），猪瘟（猪瘟二免），伪狂宁（伪狂犬病首次肌注）。同时设单个疫苗对照组，对比免疫前，免疫后30d抗体的变化，评估方案的可行性。具体操作，用口蹄疫苗作为稀释液稀释伪狂宁，然后再稀释猪瘟进行免疫。通过方法创新形成口蹄疫-伪狂犬病-猪瘟三联苗进行一次注射免疫。
4.3 “一针三防”组合免疫的结果
通过口蹄疫抗体水平分析可知，单独免疫效果与联合免疫效果相当，即联合免疫组疫苗（口蹄疫+猪瘟+伪狂犬病）注入猪体后不影响口蹄疫免疫效果，特别是联合免疫组二免后30d口蹄疫效果几乎不受影响。猪瘟抗体水平分析，免前抗体水平与一免后30d、二免后30d差异不显著；各组之间比较差异不显著，说明联合免疫不影响猪瘟免疫效果。伪狂犬病抗体分析，联合免疫组一免、二免后效果与免前差异显著，说明免疫后伪狂犬病抗体快速提升，保护力提高。
综上所述，3种疫苗同时免疫后，猪瘟苗和伪狂宁有免疫协同的作用，口蹄疫抗体无显著差异，说明“一针三防”是可行的。联苗共同刺激动物的免疫器官后有提高免疫应答的作用，口蹄疫疫苗的油佐剂兼具抗原缓慢释放的同时有免疫增强的作用。但必须意识到，不同厂家生产的疫苗因其生产工艺、佐剂类型不同，组合免疫效果差异极大。此次研究是基于金宇产品的基础上进行的组合免疫应用研究，请注意该方案的结论不适用于其他厂家的疫苗产品与金宇产品进行组合免疫，同样也不适用于其他厂家生产的产品进行组合免疫。一针三防的好处口蹄疫+猪瘟+伪狂犬病同时免疫不影响各自的免疫应答，可以有效减少免疫次数，减少人和猪的接触频率，减少人工劳力，有效降低猪只的应激，提高猪群抵抗力，70日龄肌注免疫，随着母源抗体的衰退，可以有效减少母源抗体的干扰，通过研究结论，能帮助广大养殖户，同时提供科学依据。
