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猪圆环病毒3型的起源、遗传多样性和进化动态分析

中国动物保健 2019-12-08

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猪圆环病毒3 (PCV3)是一种新型的与急性PDNS(猪皮炎和肾病综合征)相关的病毒。其高感染率可能对全球养猪业造成潜在威胁。
   猪圆环病毒3 (PCV3)是一种新型的与急性PDNS(猪皮炎和肾病综合征)相关的病毒。其高感染率可能对全球养猪业造成潜在威胁。
  
  导致PCV3出现和传播的过程至今仍鲜为人知。本研究根据可用的基因组序列确定了PCV3可能的起源、基因型和进化动态。
  
  PCV3的最近的祖先可能来源于蝙蝠圆环病毒1型。
  
  利用不同的系统发育方法,确定了两个主要的基因型:PCV3a和PCV3b。
  
  研究发现,PCV3的种群规模在2013年末至2014年初迅速增加,这可能与PCV3a和PCV3b的多样化有关。
  
  PCV3与其他单链DNA病毒相比,具有一个相对较高的有效繁殖数(Re)值和较高的变异率,并在密码子122位和320位(ORF2中的24位)上发现了阳性选择。据推测,320位抗原表位的潜在变化可能是导致PCV3逃脱宿主的免疫应答的重要原因。
  
  总之,这项研究对了解全世界正在发生的PCV3疫情具有重要意义,并将指导今后制定有效的预防和控制措施。
 


 
  
  1、简介
  
  新发病毒的持续流行病学监测对疾病控制至关重要。根据国际病毒分类委员会(ICTV),圆环病毒科包括两个属:环病毒属和圆环病毒属。在人类和黑猩猩身上都发现了环病毒属的病毒。环状病毒宿主范围广泛,包括人类、鸟类、猪、狗、和牛。
  
  在2015年以前,猪圆环病毒1 (PCV1)和PCV2被认为是唯一的猪圆环病毒类型。PCV1对猪无致病性,猪肾脏细胞系PK-15中的污染物。PCV2与显著的临床症状相关,如断奶后多系统消瘦综合征(PMWS)、猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)和免疫抑制。20世纪90年代末,首次发现了PCV2疫情,很快PCV2流行起来,给养猪业造成了严重的经济损失。PCV2是迄今为止高变异率最高的单链DNA病毒,进化动力学类似于单链RNA病毒。PCV2的基因型鉴定是基于邻居连接(NJ)树的p-距离,由2008年欧洲首次提出。然而,当更多的序列可用时,Franzo等人对此提出了质疑。目前已确认的主要基因型有PCV2a、PCV2b、PCV2d三种,PCV2c和PCV2e是两种低流行基因型。基因型转移可能与致病性和疫苗免疫的差异有关。为使疫苗适应新基因型的迅速出现,必须采用新的标准方法来定义PCV2基因型。
  
  尽管PCV2是造成养猪业巨大经济损失的原因,但其起源和演变仍存在不确定性。最近,通过对母猪流产胎儿的下一代序列(NGS)分析,发现了一种新的圆环病毒,并将其命名为PCV3。新发现的病毒与PDNS有关。PCV3感染可能导致PDNS和生殖功能衰竭、心脏和多系统炎症。也有研究表明,在流产胎儿中发现的PCV3是垂直传播的结果。与PCV2一样,在PCV3的基因组中有两个主要的开放阅读框(ORFs): ORF1编码参与病毒复制的蛋白(Rep), ORF2编码主要的结构蛋白,衣壳蛋白(Cap)。PCV3序列在美国、中国、巴西、泰国、韩国、欧洲等多个国家(包括波兰、意大利、西班牙、丹麦、德国、英国等)广泛检测到。起初认为美国首次发现的PCV3与犬圆环病毒的关系更为密切。随后,随着PCV3在中国和其他国家的检测,一项研究报告指出,PCV3与一些蝙蝠圆环病毒密切相关。我们认为犬CVs和蝙蝠CVs可能在包含PCV1和PCV2的簇中共享一个祖先。由于采用了不同的系统发育方法和参考序列,以往关于PCV3起源的研究难以解释和比较。
  
  虽然系统发育分析是研究PCV3进化的一种强大工具,但是不同的研究对这些方法的使用存在大量不同的推论方法,并且缺乏一致性。考虑到PCV3 (蝙蝠或犬类)起源的争议,我们使用最大似然(ML)和MCMC方法分析了选定的可用ORF1圆环病毒序列,以更准确地追踪PCV3的起源。另外,利用NJ、ML、MCMC等方法,对2017年11月前 GenBank的所有完整的PCV3序列进行分析,研究其分子遗传关系。我们的结果提供了一个关于PCV3起源、遗传多样性和进化动态的全球性观点,并表明了阳性选择和高变异率,支持了PCV3正在发生的基因型转变和暴发。
  
  2、结果
  
  2.1世界范围内突发的PCV3病毒起源的时间证据
  
  采用RDP4检测重组,我们没有检测到PCV3的重组证据。然而,KY418606序列由于质量低而被删除。为了追溯PCV3的起源,使用ORF1基因序列重建了ML树(图1a)。我们发现所有的PCV3株都与蝙蝠CVs 1型密切相关,且具有较高的置信度。来自中国的蝙蝠圆环病毒1型(JQ814849)作为作为蝙蝠毒株和PCV3毒株的一个外群,提示可能起源于蝙蝠CV。
  
  此外,我们还发现,在Wu等人的研究中,PCV2和PCV1株与蝙蝠CVs 2型密切相关。还发现犬类CVs与蝙蝠CVs 2型以及PCV1和PCV2株密切相关。然而,此前有报道称,犬CVs病毒在比较完整基因组时与PCV3株密切相关,尽管可信度较低。这支持了在将来推断猪圆环病毒起源时应该使用保守的Rep蛋白的观点。此外,用101个ORF1序列中的81个重建的最大支可信度(MCC)树(图1b)与ML树具有相似的结构,并证明了由于目前可用的序列数量不足,该树与具有不确定发散时间的蝙蝠CVs 1型具有密切的关系。
  
利用ORF1的保守编码区推算PCV3的起源
  图1  利用ORF1的保守编码区推算PCV3的起源
  
  2.2 根据系统发育分析进行PCV3基因分型
  
  我们使用ML、MCC和NJ方法重建了PCV3完整基因组序列(ORF1+ORF2)的系统发育树。在三棵不同的树中观察到两个独立的支系,它们的结构相似(图2a、b和图3b)。有趣的是,对不同支系中序列分布的详细分析表明,除了一个支系中有几个支系外,不同算法的序列结构是相似的(PCV3-China/GX2016-3, PCV3-China/GX2016-2,PCV3/CN/Guangdong-HY1,PCV3-China/GX2016-1,PCV3-US/MN, PCV3/CN/Jiangxi-B1, PCV3/KU-1609, PCV3/KU-1608, 2164, PCV3-CHN/GD)。鉴于完整基因组序列的稳定分支,我们将其分别命名为PCV3a和PCV3b。PCV3a分支包括2015年在美国首次发现的毒株(PCV3-US/MO/2015)。此外,PCV3a可以被分成两个结构稳定的独立亚枝,分别称为PCV3a-1和PCV3a-2。我们观察到在PCV3a分支中有几个毒株的分布是随机的,我们将这些毒株称为IM株。
  
  然而,使用ORF2构建的NJ和ML树没有显示清楚的集群,特别是在NJ树中。例如,在用109个ORF2序列构建的NJ树中,PCV3a-IM中的一些毒株与PCV3b聚类。当ORF2基因的参考序列数目增加时,系统发育不一致。因此,我们建议使用完整的编码序列进行PCV3基因分型。
  
PCV3全基因组序列的系统发育分析
  图2  PCV3全基因组序列的系统发育分析
  
  2.3  PCV3的演变和流行病学动态分析
  
  利用BEAST (v1.8.4)估计最近祖先的时间(tMRCA)和完整编码序列和单个基因的核苷酸替换率。PCV3a的tMRCA为2013.04。其中,PCV3a-1、PCV3a-2、PCV3b的tMRCA分别为2013.80、2013.61、2013.44,说明PCV3a亚型在2013年经历了快速繁殖。此外,ORF2和ORF1的tMRCA也被估计,并显示出与完整编码序列相似的模式。总体而言,基于单个基因或完整的编码序列分析,过去三年PCV3的tMRCA均值为2013年末。
  
  此外,PCV3毒株的完整基因组序列的平均变异率为1.69 × 10−3次/位点/年,高于先前报道的PCV1 (1.15 × 10−5),更接近PCV2 (1.2 × 10−3)。此外,为了获得PCV3系统进化的更详细信息,我们根据特定的分支和单个基因来预测变异率。如图4所示,据完整编码序列,PCV3a-1和PCV3b的变异率为2.1 × 10−3,PCV3a-2为1.6 × 10−3。此外,我们还观察到,ORF1与ORF2基因拥有类似的进化速率。
  
  根据Skyline Plot和MCC树,我们发现PCV3可能从2013年下半年到2014年上半年出现了多样化(图3a)。此外,PCV3的各种分支(PCV3a-1、PCV3a-2和PCV3b)也在这个时候形成(图3b)。
  
  此外,我们还调查了全世界新出现的PCV3的流行病学动态。我们发现2015年至2017年有效繁殖数(Re)的估值存在明显的时间差异。尽管有不同的系统发育史,但根据2016年的流行病学模型,PCV3a和PCV3b的Re值相似,分别为3.08和1.82。这表明PCV3有可能成为地方性猪病。鉴于2015年和2017年的序列数量有限,我们认为2016年的Re值是有效的。
  
  PCV3地理分布的相关性表明,关联指数(AI)和PS指数的p值均<0.05。中国单系(MC)的p值<0.05(表1),说明PCV3在中国的地理相关性显著。而美国、韩国、巴西的p值均>0.05。总体而言,PCV3与地理位置之间存在相关性,但由于可用序列相对较少,相关性较弱。
  
PCV3全基因组序列遗传差异
  图3  PCV3全基因组序列遗传差异
  
  图4  BEAST(v1.8.4)估算PCV3的tMRCA和变异率
 
 
  表1  PCV3毒株与地域之间的相关性分析
  
  2.4  氨基酸分析和免疫表位预测
  
  共56个PCV3完整基因组序列用于相关分支的氨基酸分析。122、320和323氨基酸位点是区分PCV3a和PCV3b的关键。与PCV3a相比,这些氨基酸位点在PCV3b中分别为S122A、A320V、R323K,在PCV3a-IM中分别为R323K。这些结果进一步验证了基于系统发育结构的基因分型结果。此外,表位预测表明PCV3a和PCV3b中有7个潜在的表位。PCV3抗原表位几乎跨越了蛋白质的整个表面,在图5中用不同的颜色表示。结合表位预测和氨基酸分析,我们发现ORF2的24位氨基酸位于一个预测的表位区域。如前所述,PCV3a和PCV3b的24位氨基酸是不同的,从图5可以看出,PCV3a和PCV3b的表位结构是不同的。这可能说明PCV3a和PCV3b的抗原性是不同的。需要进一步的实验研究来验证预测的表位区域的免疫原性差异。
  
  图5  PCV3a和PCV3b参考毒株的抗原表位预测
  
  2.5  PCV3全基因组序列的选择分析
  
  我们发现,在单个密码子中,有3个密码子(5、122和320位点)是阳性选择,p值<0.1(表2)。位于ORF1编码区的密码子122和对应于ORF2编码区的24位氨基酸,经FEL和MEME至少两种方法证实为阳性选择,p<0.05,SLAC的p<0.1,FUBAR的后验概率>0.9。
  
  表2  PCV3全基因组序列的选择分析
  
  3、讨论
  
  自2015年发现PCV3以来,大多数研究都集中于单个分离株的遗传特征以及临床和流行病学调查。在此,我们为PCV3的起源、流行病学和演变提供了新的见解。我们确定了PCV3的起源,并提出了导致全世界出现PCV3的进化途径,其准确性高于以前的研究。
  
  首先,我们使用保守编码序列(ORF1)来追踪潜在的起源,这是一种比以前应用于完整基因组更好、更准确的方法。我们发现2011-2013年在中国分离出的蝙蝠CVs 1型与PCV3具有最近的共同祖先。有趣的是,我们发现了一些与之前报告的不同之处。猪NW2/USA/2009毒株与PCV3分支聚集在一起,之前有报道称PCV3是系统发育中唯一的外群。因此,我们假设PCV3的出现早于2009年在猪身上的首次检测。然而,准确的起源和分化时间需要深入的流行病学调查来证实。
  
  第二,与以前的研究相比,包含了更多的参考序列,我们证实了PCV3实际上是从蝙蝠CVs 1型开始多样化的。此外,根据之前的研究,我们发现PCV1和PCV2与蝙蝠CVs 2型的分支密切相关,而与鸟类无关。
  
  总的来说,根据当前可用的序列,蝙蝠CVs 1型最有可能是PCV3的起源。一般认为,蝙蝠是新发传染病的重要宿主。圆环病毒宿主的跳跃可能对养猪业和公众健康都有风险,就像最近报道的在猪身上发现的源于蝙蝠的冠状病毒一样。
  
  鉴于先前PCV2基因分型的NJ p-距离法受到Franzo等人的质疑,我们根据最近暴发的PCV3毒株探索了的系统发育史。在PCV3的基因型鉴定中,采用了NJ、ML和MCC三种不同的算法,并鉴定了两个稳定的基因型(PCV3a和PCV3b)。此外,在PCV3a型分支中,发现了两个稳定的亚分支和灵活的IM分支。与以往的研究相比,利用完整的编码序列推导出的发育树更加稳定和准确。另一方面,氨基酸分析显示,S122A和A320V对PCV3a和PCV3b支的鉴别至关重要。
  
  尽管基因型鉴定和氨基酸分析已被Fu和Fux等人报道,但是需要注意的是:
  
  1. 两项研究都包括低测序质量的KY418606毒株,误导了系统发育树的分支结构。
  
  2. 这两项研究的亚基因型鉴定不是基于全基因组,而我们是使用全基因组序列。
  
  3. 在我们的一项未发表的研究中,通过使用不同序列的PCA证实了用完整全基因组序列重建的系统发生树中观察到的稳定分支结构。因此,今后应利用完全全基因组序列的无根ML树来推导PCV3的精确系统发育树和基因型鉴定。
  
  系统动力学分析表明,PCV3a的分化早于PCV3b。我们认为PCV3a和PCV3b的短散度时间是由于缺少足够数量的PCV3序列。时间线图显示,从2013年末到2014年初,PCV3种群迅速增长和扩大。在此期间,形成了PCV3a和PCV3b。流行病的初始阶段通常与指数增长相关(对应于Re=R0)。根据定义,Re必须小于等于R0。如果R0或Re值大于1,则可能发生流行。我们预测2016年PCV3a和3b的Re分别为3.18和1.82。此外,PCV2在单链DNA病毒中的高变异率,使其能够经历类似于单链RNA病毒的进化动力学,从而增强了PCVD的全球出现。有趣的是,PCV3表现出比PCV2更高的变异率,这可能有利于PCV3适应不同的生物学条件,对猪种群构成更大的威胁。
  
  总的来说,这些预测结果与PCV3的实际流行相一致,并表明PCV3a和3b在未来具有广泛传播的高潜力。因此,对该病的流行病学调查是预防的关键。此外,我们的分析揭示了与中国地理分布相关的流行病学特征,这可能表明一旦PCV3毒株进入特定地区,它们可能会适应当地的宿主。重要的是,ORF2蛋白的24位氨基酸被预测为一个潜在的表位,并处于阳性选择状态。这个位点可能是PCV3从宿主免疫系统逃逸的关键,导致循环延长,使PCV3a向PCV3b分支分化。
  
  综上所述,我们更准确的确认了PCV3的蝙蝠起源,并提供了一个完整的基因型鉴定。此外,我们还首次报道了PCV3取代PCV2成为变异率最高的单链DNA病毒。快速增长的种群和相对较高的Re值揭示了未来持续暴发的可能性。总之,我们的研究有助于了解全世界正在发生的PCV3感染,并将指导今后制定有效的预防和控制措施。
 
 
 
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